hPIN1基因酵母双杂交表达载体的构建及其毒性与自激活效应检测.doc

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1、此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除hPIN1基因酵母双杂交表达载体的构建及其毒性与自激活效应检测孟祥贵1黄轶2　杨梅华3刘立杰1(1第三军医大学新桥医院健康体检中心，重庆400037；2重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室,重庆市生化与分子药理重点实验室，重庆400016；3第三军医大学新桥医院神经外科，重庆400037)[摘要]目的　克隆人肽基脯氨酰顺反异构酶PIN1基因，构建酵母双杂交系统表达载体，并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用及对报告基因有无激活作用。方法运用RT-PCR从人胃癌组织中扩增PIN1基因片段,平端克隆入环状自连pMD18-T载体，测序鉴定后

2、以此为模板再次扩增相应片段克隆入酵母双杂交载体pGBKT7与pGADT7中。醋酸锂法转化酵母菌AH109,检测诱饵蛋白对酵母AH109有无细胞毒性及对报告基因有无激活作用。结果成功克隆出序列正确的PIN1基因,并正确构建PIN1基因的酵母双杂交表达载体。PIN1蛋白对酵母菌AH109无细胞毒性,对报告基因亦无自激活作用。结论可以利用酵母双杂交系统来研究“诱饵”PIN1相互作用的蛋白。[关键词]:基因；克隆；肽基脯氨酰顺反异构酶，PIN1；酵母双杂交中图法分类号：Q782文献标识码：AExpressionandconstructionofyeastexpressionplasmi

3、dcontaininghumanPIN1geneinyeasttwo-hybridsystemMENGXiang-gui1,HUANGYi2,YANGMei-hua3,LIULi-jie11HealthScreeningCenter，XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400037，China;2DepartmentofBiochemistryandMolecular，ChongqingBiochemicalandPharmacologicalKeyLaboratory,ChongqingMedical

4、University，Chongqing400016，China，3DepartmentofNeurosurgery，XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400037，China.[Abstract]AIM:ToconstructyeastexpressionvectorcontaininghumanPIN1geneinordertoscreenitsinteractionproteinsinyeasttwo-hybrid.MethodsHumanPIN1genewasamplifiedbyRT-PCR

5、fromhumangastriccancertissueandinsertedintopMD18-Tbyblunt-blunt——————————此文档仅供学习与交流此文档收集于网络，如有侵权，请联系网站删除作者简介：孟祥贵,男，教授，主任医师，硕士生导师，Tel：（023）68755674，Email：yihuang828@yahoo.com.cn通讯作者：黄轶,男，讲师，Tel：（023）68485398，Email：yihuang828@yahoo.com.cnligation.Afterverifiedbysequencing,thebaitpGBKT7-PIN1and

6、pGADT7-PIN1wereconstructedwithpMD18-T-PIN1astemplate.PIN1baitplasmidwassubsequentlytransformedintoyeastcellAH109,anditstoxicitytoAH109andtranscriptionalactivatitiontoreportergeneweretestedwithyeasttwo-hybridsystem..Results:HumanPIN1genewasabtainedsuccessfully.SequenceanalysisrevealedthatPIN1

7、genewerein-frameinsertedintopGBKT7andpGADT7vectors.ItsexpressionproductshowedtobenontoxictoAH109anddidnotactivatethereportergenes.ConclusionTheplasmidpGBKT7-PIN1canbeappliedasabaittotraptheinteractionproteinfromcDNAlibrarybyusingyeasttwo-hybrid.[Ke