细胞培养第四章 细胞培养的基本技术.doc

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1、第四章细胞培养的基本技术第一节基本操作技术和要求r1培养室内的无菌操作内謂2培养细胞的取材匚3各类组织的取材技术1*培养室内的无菌操作1.1*培养前准备：实验前要制定好实验计划和操作程序,有关数据的计算要事先做好1」」根据实验要求，准备各种所需器材和物品;1.1.2清点无误后将各种所需器材和物品放置操作场所（培养室、超净台）内;可避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。1.2*培养室和超净工作台的消毒：1.2.P无菌培养室：⑴每天都要用0.2%的新洁尔灭或2%・5%来苏尔拖地面一次（拖布要专用）；（2）紫外线

2、照射消毒30〜50min。1.2.2*超净工作台：台面每次实验前要用75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30min。1.2.3*注意：⑴在工作台而消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线；（2）消毒吋工作台面JL用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线，降低消毒效果；（3）一些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同吋紫外线照射消毒。]・3*洗手和着装.1.3.1原则上须彻底洗手并按外科手术要求着装;1.3.2无菌服、帽子和口罩每次实验后都要清洗消毒；1.3.3开始操作前要用75%酒精或0.2

3、%新洁尔灭消毒手和前臂。1.3.3*注意：⑴如果实验过程屮手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手；⑵平时仅做观察不做培养操作时，可穿经紫外线照射30min的一般清洁工作服；（3）培养室外最好准备好几套以上的工作服，便于随时进入培养室穿用。1•护无菌培养操作：1.4.1在实验前，要点燃酒精灯或煤气灯，一切操作如安装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都应在火焰近处并经过烧灼进行。1.4.2宕注意：（1）金展器械不能在火焰屮长时间烧灼，以防退火；（2）烧过的器械要冷却后才能使用，如银子应冷却后才能夹取组织，否则可能造成

4、组织细胞损伤；（3）已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用吋会将其带到培养基屮；（4）开启和关闭有细胞生长的培养瓶吋，火焰灭菌时间要短，防止因温度过高烧死细胞（5）胶塞、橡皮乳头及塑料的细胞培养用品过火焰时也不能时间过长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞，塑料细胞培养用品会产生变形影响使用。（6）工作台面上的用品要放置有序、布局合理，例如：酒精灯在屮间，右手使用的物品在右侧，左手用品在左侧；（7）工作吋忌忙乱血要有顺序；（8）组织、细胞及培养板在未做处理和使

5、用前，不要过早暴露于空气屮；R]34C二二「⑥图5-1培养用品布局1酒精灯7缓冲液2废液缸8培养瓶架3培养液架9培养瓶4吸管架10吸管5后备品U瓶帽6培养液(9)应分别使用不同吸管吸取营养液、PBS、细胞悬液及其他各种用液而不能混HL(10)用吸管、注射器进行转移液体操作时，吸管、注射器针头、不能触及瓶口以防止细菌污染或细胞的交叉污染；(11)培养瓶、培养液瓶不要过早打开，已开口者要尽量避免垂直放置以防止下落细菌的污染；(12)放置吸管时管口向下倾斜，以防液体倒流入橡皮乳头内引起污染。(13)进行培养操作时，不要用手触

6、及已消毒的器皿，如己接触，要用火焰烧灼或取备用品更换；(14)而向操作野时勿大声讲话或咳嗽，以免喷出的唾沫把细菌等带入工作台面发生污染。2培养细胞的取材人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步。2.1*取材的基本要求2.1.P取材要注意新鲜和尽快培养：新鲜组易于培养成功(1)取材吋应尽量在4・6h内能制作成细胞，尽快入箱培养；⑵若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4°C存放;(3)若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4°C存放，但时间不能超过24

7、h;⑷对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砚的培养基，按细胞冻存方式于液氮屮冷冻保存。2.1.2*取材应严格无菌：(1)用无菌包装的器U1L或事先消毒好的、带少许培养液(内含400单位/mL抗菌素)的小瓶等便于携带的物品来取材；(2)所取材料应尽量避免紫外线照射和接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。(3)对所取材料若疑有污染的可能(如从消化道、周围有坏死组织等)，应将所取组织在含青、链霉素(500-1000U/mL)PBS液漂洗5-10min或10%达克宁注射液冲洗浸泡lOmin后，再培养。(4)取材

8、和原代细胞制作吋，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤；(5)要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织，切碎组织吋应避免组织干燥，可在含少量培养液的器皿屮进行；(6)原代培养，特别是正常细胞的培养，应采用营养丰富的培养液，最好添加胎牛血清。含量为：10%・20%；(7)取材应注