感受态细胞的制备及重组质粒的转化.ppt

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1、感受态细胞的制备及重组质粒的转化experimentsofmolecularbiology重组DNA技术分：分离外源基因目的基因。切、接：利用酶学方法，将外源基因与载体连接，形成复制子。转：转化宿主细胞，使复制子可以扩增复制。筛：筛选含有目的基因的细胞(转化子)并扩增以获得目的基因克隆。重组DNA技术的基本工具“分子手术刀”限制性核酸内切酶“分子运输车”“分子缝合针”DNA连接酶“分子运输车”基因进入受体细胞的载体受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能允许含有外源DNA的载体分子通过的细胞，即感受态

2、细胞(competentcell)。感受态细胞(competentcell)是将异源DNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。转化是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。转化（transformation）化学的方法(CaCl2法、热休克法)：使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热休克处理将载体DNA分子导入受体细胞。电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。转化的方法转化原理（CaCl2法）将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨

3、胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域；此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗DNase的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。转化过程所用的受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体。CaCl2法是目前常用的感受态细胞制备方法，简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15-

4、30％的无菌甘油于-70℃保存(半年)。影响转化效率的因素影响因素细胞生长状态和密度杂菌和其它外源DNA的污染载体DNA及重组DNA受体细胞试剂的纯度和器皿的洁净度转化操作实验原理本实验以E.coliJM109菌株为受体细胞，并用CaCl2处理使其处于感受态，然后与pMD19-T-X重组质粒共保温，实现转化。由于重组质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pMD19-T-X重组质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。能在含Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）已导入了重组质粒。抗Amp宿主细菌含Amp培养基实验

5、仪器、材料1．超净工作台2．高速离心机3．恒温摇床4．恒温培养箱5．恒温水浴锅6．制冰机7．移液枪实验材料、试剂1．大肠杆菌JM109菌株2．重组质粒3．1.5mL离心管，Tip头4．试管、培养皿1．LB液体培养基2．含有Amp的LB平板培养基（终浓度为50µg／mL）3．氨苄青霉素贮存液（浓度50mg／mL）4．0.1mol/LCaCl2溶液实验安排1受体菌的培养感受态细胞的制备23质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化实验安排一、受体菌的培养从新活化的E.coliJM109平板上挑取一单菌落，接种于3mlLB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期

6、。（已做）将该菌悬液以1:50转接于50mlLB液体培养基中，37℃250rpm振荡扩大培养约1-2h，当OD600nm值为0.3～0.5时，取出置冰浴。1、取1mL菌液于1只1.5mL离心管中，置冰浴5min，10000rpm离心1min（每班需做对照管至少1管）（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；2、弃上清，将离心管倒置于干净吸水纸上，每管加入0.5mL冰预冷的0.1mol/LCaCl2悬浮细菌，置冰浴10min；3、4000rpm离心10min，弃上清；4、每管加入50μL冰预冷的0.1mol/LCaCl2悬浮细菌，冰上放置，即为

7、感受态细胞。二、感受态细胞的制备1、实验管加5μL重组质粒DNA，对照管加5μL灭菌水，轻轻混匀，置冰浴20min；2、42℃水浴热应激90s（精确计时），迅速放回冰浴，冷却5min后加入1mLLB液体培养基（不含Amp），37℃250rpm振荡培养约1h；3、取50μL菌液均匀涂布在LB琼脂平板上（含50μg/mLAmp，事先做好），37℃培养过夜（12-16h）后观察结果。三、质粒向感受态大肠杆菌细胞的转化切记：玻璃棒经酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫！对照组：以同体积的灭菌双蒸水代替重组质粒，其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素（Amp）

8、的LB琼脂平板上应没有菌落出现。本次实验组预期结果：感受态细胞长时