25 生物化学实验--大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化

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1、大肠杆菌感受态细胞的制备及重组质粒的转化【目的】1.掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验方法和技术。2.熟悉大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的实验原理。【原理】1.大肠杆菌感受态细胞的制备、转化原理细菌的生物学特性由于吸收外源DNA发生可遗传的改变叫转化，在基因克隆技术中，转化（transformation）特指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。转染（transfection）是指噬菌体、病毒或以它为载体构建的重组子导入细胞的过程。未经特殊处理的宿主细胞较难进行转化，细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态，用理化方法诱导细胞进入感受

2、态的操作叫致敏过程。重组DNA转化细菌的技术操作关键就是通过一定的方法，人工诱导细菌进入一个敏感的感受态，以便外源DNA进入细胞内。本实验采用氯化钙溶液处理对数生长期的E.coli.DH-5α细胞,使E.coli.DH-5α细胞的通透性增加，摄取外来DNA（本实验中的质粒DNA为pUC-18）能力增加，其原理为当细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNAase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖，被转化的细菌

3、中，重组子中基因得到表达。2.转化大肠杆菌的筛选由于pUC-18（如图）含有Ampr（氨苄青霉素抗性）基因便具有在含Amp培养基上生长的能力，形成单个菌落，而未转入pUC-18的E.coli.DH-5α细胞，不具有Ampr基因，在含Amp的培养基中，生长受到抑制，不能形成肉眼可见的菌落，从而使转化和未转化宿主细胞得以区分开来。进一步将转化菌涂布在含IPTG和X-gal的LB平板上，由于pUC-18还带有一段大肠杆菌β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的启动子及其编码α-片段的DNA序列，此结构成为lacZ＇基因，在lacZ＇基因中的靠近5＇端有一段多克隆位点（

4、MCS），而大肠杆菌含有β-半乳糖苷酶ω片段的编码基因，尽管载体和宿主编码的这两个片段都没有活性，但两者同时存在时能够融为一体，形成具有酶活性的蛋白质，这样lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。图23-1质粒pUC18图谱

5、图23-2质粒pUC18酶切图谱【器材】•高速温控离心机•超净工作台•恒温水浴箱•10ml离心管、1.5m1EP管•培养皿（φ9cm）•酒精灯•推子•摇床•可调微量移液器•10ml试管、100ml三角瓶•恒温培养箱•0.45μm、0.22μm滤膜•封口膜【试剂】1．E.coli.DH-5α菌种2．pUC-18质粒（0.5μg/μl）3．LB（Luria-Bertani）液体培养基：细菌培养用胰化蛋白胨（bacto-tryptone）10g、细菌培养用酵母抽提物（bacto-yeastextract）5g、NaCl10g、加去离子水至800ml，搅拌，使溶

6、质完全溶解。用5mol/LNaOH（约0.2ml）调节pH值至7.4，加去离子水至总体积为1L，以1.034×105Pa高压蒸气灭菌20分钟。4．LB固体培养基上述LB液体培养基中按15g/L加入细菌培养用琼脂（bacto-agar），以1.034×105Pa高压灭菌20分钟。溶液尚未冷却时，即应取出培养基，并轻轻转动以使溶解的琼脂均匀分布于整个培养基溶液中。5．0.1mol/LCaCl2溶液用蒸馏水溶解11g的CaCl2，定容至1000ml，1.034×105Pa，高压灭菌20分钟，-20℃保存。6．氨苄青霉素（Amp）溶液取未开封氨苄青霉素粉0.5g

7、，加入灭菌蒸馏水5m1，配制成100mg/ml溶液，过滤除菌，-20℃分装保存。7．IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）取1gIPTG溶于4ml去离子水中，再用水补至5ml，用0.22μm滤膜过滤除菌，每份1ml分装后，-20℃保存。8．X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储存液，不需滤过除菌，保存于1.5mlEP管中，用铝箔包裹贮存于-20℃避光保存。9．甘油50ml取50ml甘油，121℃,30分钟高温灭菌。【操作】1．感受态细胞的制备灭菌操作步骤于超净工作台中进行，下同。（1

8、）用无菌小枪尖从E.coli.DH-5αLB平板上挑单菌落，将此枪尖放于含5m1