大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化_实验报告

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1、分子生物学实验报告实验名称：大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化班级：生工xxxx姓名：xxx学号：xxx日期：xxx4大肠杆菌感受态细胞的制备及重组子的转化1引言在分子生物学日益普及的今天，基因操作已成为一项重要的常规技术。体外连接的DNA重组体导入合适的受体细胞便能大量地复制、增殖和表达，从而得到大量的重组基因，其中尤以转化为主[1]。感受态细胞的制备是分子生物学研究中的一个重要环节，其制备质量的好坏直接影响到后续实验工作的进行。本次实验的目的旨在了解转化的概念，及其在分子生物学研究中的意义，学习氯化钙法制备大肠杆菌感受

2、态细胞的方法。2材料和方法2.1实验原理质粒DNA需经过转化过程（transformation），才能将其导入感受态细胞（competentcell）或者大肠杆菌体中，然后通过寄主细菌的系统来达到复制DNA的目的。进行细菌转化作用最常用的一种方法是加入大量的氯化钙（calciumchloride），导致大肠杆菌的细胞壁发生结构上的变化，变成感受态细胞，而有利于质体DNA进入细菌细胞内。大部分大肠杆菌品系的转化效率在105-108之间，即每μg质粒DNA中成功的转化细胞数目，影响此效率的因子与感受态细胞状況或吸收DNA的能力有关

3、。而这2项因子又受细菌是否处于对数生长期、处理时是否将细胞保持在4°C以下，以及氯化钙处理细胞的时间影响。感受态细胞制备完成后，利用热休克处理，使细胞质膜的油脂变性而刺激转化作用，而后给予一段时间恢复后，可用对抗生素之抗性标记，进行筛选工作。本实验是利用冰冷的氯化钙溶液制备感受态细胞，其转化效率约在105-107之间。转化（transformation）是将异源DNA分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传形状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。本实验以EcoliDH5α菌株为受体细胞，

4、用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pMD18-T载体共保温，实现转化。pMD18-T载体是一种高效克隆PCR产物(TACloning)的专用载体。这种载体是由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在两侧的3'端添加"T"而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3'末端添加一个"A"的特性，所以使用这两种制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。该载体携带有抗氨苄青霉素基因，因而使接受了该

5、质粒的受体菌具有抗氨苄青霉素的特性，同时还能进行蓝白斑筛选，其中有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞。因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。由α-互补而产生的

6、LacZ+细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别。然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，几乎不可避免4地导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选。如用蓝白斑筛选则经连接产物转化的钙化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。图1为pMD18-T载体的克隆位点图[2]。图1pMD18-TVector的克隆位点图2.2实验材料2.2.1仪器所用仪器有超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、

7、恒温水浴器、制冰机等。2.2.2器皿所用器皿有移液枪（2.5ul、10ul、1000ul）、枪头盒（蓝、黄）、枪头（蓝、黄）、培养皿、1.5ml离心管、泡沫塑料盒、带帽试管、250ml锥形瓶、酒精灯、浮子等。2.2.3试剂所用试剂有0.1mol/LCaCl2溶液，购买的感受态细胞，LB液体培养基，LB固体培养基，氨苄青霉素（Amp），X-gal，IPTG等。2.3实验方法从大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落接于50mlLB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜（16小时）。分别取2.0ml菌液转接到三个含有100mlLB液体

8、培养基锥形瓶中,37℃振荡培养2-3h。(此时,OD600<=0.5,细胞数务必<108/ml,此为实验成功的关键)。将菌液转移到1.5ml离心管中,冰上放置30min。在低温离心机中于4℃离心10min(4000rpm),回收细胞。倒出培养液,将管倒置1min以便培养液流尽