重组质粒的转化.ppt

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1、重组质粒的转化外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过各种方法筛选出重组子，并可通过酶切电泳进行重组子的鉴定。感受态理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。它决定于受体菌的遗传特性，同时与菌龄、外界环境等因素有关。感受态细胞制备方法及原理目前常用的感受态细胞制备方法有CaCl2法，制备好的感受态细胞可以加入终浓

2、度为15%的无菌甘油，-70℃可保存半年至一年。经过CaCl2处理的细胞细胞膜通透性增加，允许外源DNA分子进入。该方法简便、快速、稳定将快速生长的大肠杆菌置于经低温（0℃）预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀，细胞膜通透性发生变化，CaCl2法制备感受态细胞影响因素细胞的生长状态：对数生长期试剂质量：分析纯杂菌和杂DNA污染：所用器皿、试剂均需灭菌温度：冰上操作转化是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。在低温下，将携带有外源DNA片段的载体与感受态细胞混合，经过热激或电穿孔技术

3、，使载体分子进入细胞。进入受体细胞的外源DNA分子通过复制、表达，使受体细胞出现新的遗传性状。将这些转化后的细胞在选择性培养基上培养，即可筛选出重组子。转化过程所用的受体细胞一般是限制－修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。方法及原理热激法：使用化学试剂（如CaCl）制备的感受态细胞，细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基－磷酸钙复合物。此时，将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激（90s），细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。操作步骤取10

4、0µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，加入10µl重组质粒DNA(体积不超过10µl)+100µl感受态细胞将以上样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－2min，然后迅速冰上冷却2min立即向上述管中分别加入LB液体培养基（不需在冰上操作），摇匀后于37℃振荡培养约45-60min，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物。提高转化效率的方法感受态质量质粒DNA的相对分子质量和浓度防止杂菌和杂DNA污染重组子的筛选转化后的细胞在筛选培养基中培养，可筛选出转化子蓝白斑筛选蓝白斑筛选

5、是一种基因工程常用的重组菌筛选方法。野生型大肠杆菌产生的β-半乳糖苷酶可以将无色化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的物质5-溴-4-靛蓝。有色物质可以使整个培养菌落产生颜色变化，而颜色变化是鉴定和筛选的最直观有效的方法。筛选原理IPTG可以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的启动子，在含有X-gal的固体平板培养基中菌落呈现蓝色。当外源DNA（即目的片段）与含lacz'的载体连接时，会插入进MCS（即靶基因），使α肽链读码框破坏，不产生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培养基中的X-gal产生蓝色，培养表型即呈现白色菌落。通过看培养皿上的菌斑的颜色就能

6、直接知道是否有DNA插入。MCS无插入时，互补，蓝菌斑。MCS有插入时，不互补，白菌斑。IPTG诱导的结果：抗生素抗性筛选实验中，通常蓝白筛选是与抗性筛选一同使用的。含X-gal的平板培养基中同时含有一种或多种载体所携带抗性相对应的抗生素，这样，一次筛选可以判断出：未转化的菌不具有抗性，不生长；转化了空载体，即未重组质粒的菌，长成蓝色菌落；转化了重组质粒的菌，长成白色菌落。转基因技术什么是转基因技术？1983年，世界上第一例转基因植物在美国成功培植，当时就曾有人惊呼：“人类开始有了一双创造新生物的‘上帝之手’。”有人预言，21世纪将是转基因作物的一

7、个转换期，科技含量将有很大的提高。转基因技术就是将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰。人们常说的“遗传工程”、“基因工程”、“遗传转化”均为转基因的同义词。基因工程和选择性繁殖技术有什么不同转基因技术与选择性繁殖都会改变生物的基因。转基因技术可以实现基因在不同物种之间的传递和流动。可以实现物种间的基因转移。转基因技术转移的基因更明确，更有目的性。选择性繁殖实验过程缓慢。基因工程技术筛选优良品种的周期更短，利用基因工程，可以很容易地进行物种的杂交。23“选择性繁殖”技术24植物转基因方法直接

8、基因转移方法:基因枪法、PEG介导的原生质体法、花粉管通道法、电激转化法等，其中基因枪转化法是代表。生物介导的转化方法，主