重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定

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1、重组质粒的转化及阳性克隆的鉴定来源：生物谷2007-5-1422:34:00访问量：7982评论(0)分享01材料E.coliJM109菌株2仪器、用具超净工作台、离心机、恒温摇床、恒温培养箱、培养皿、试管、1.5ml离心管、电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、移液器3试剂⑴CaCI2、LB平板(见附录)；SOC培养基(见附录)；SOB培养基(2)RNaseAl；BufferSI；BufferS2；BufferS3；BufferWl；无水乙醇的BufferW2a(3)IX电泳缓冲液(TAE)；漠化乙锭溶液(EB)［有毒，小心

2、］;琼脂糖；6X加样缓冲液(4)酚；氯仿；异戊醇(5)ddH2O；10XPCRBuffer(Mg2plus)；dNTP；M13；M13-；TaKaRarTaq酶4方法1.大肠杆菌感受态细胞的制备(1)取大肠杆菌JM209保存液50Ul,接种于4mlLB(或SOB)液体培养基中，37°C,300rpm振荡培养过夜，第二天取50uI转接到新的4mlLB(或SOB)液体培养基屮扩大培养3h至0D600二0.35〜0.4,在无菌操作台上取lml菌液于1.5ml离心管中，冰浴lOmino(2)4°C,5000rpm离心2min

3、,去上清液。(3)加入750Ul预冷的0.1MCaCI2重悬菌体，冰浴30mino(4)4°C,5000rpm离心2min,弃上清液。(5)加入100Ul冰冷的0.1MCaCI2轻轻重悬菌体，冰浴2h后，4°C保存备用。2.重组DNA的转化(1)将含Amp、X-Gal>IPTG的LB平板37°C预热。(2)于100Pl感受态细胞中加入10Pl连接产物，冰浴30mino(3)将离心管转入42°C水浴，热冲击90秒，然后不要摇动离心管，迅速将英放在冰上2mino(4)在离心管中加入SOC培养基300Ul,枪头混匀，3丁C

4、、150rpm温和摇振60mino⑸将200Pl转化菌液均匀地涂布于含50mg/mlAmp>20mg/mlX-gal>200mg/mlIPTG的LB平板上，37°C倒置培养过夜，挑选白色菌落进行鉴定。注意事项:%1制备感受态细胞的全部操作均须于冰浴操作，同时注意近火无菌操作，防止感受态细胞受杂菌污染。%142°C热处理时很关键，转移速度要快，且温度要准确。%1菌液涂皿操作时，应避免反复来回涂布，因为感受态细菌的细胞壁有了变化，过多的机械挤压涂布会使细胞破裂，影响转化率。1.重组质粒的鉴定方案一菌落PCR(1)制备PC

5、R混合液:(2)用经灭菌的10Pl枪头(不用牙签)挑去白色菌落，迅速地使挑取物溶在上述混合液中。(3)盖上离心管得盖子，在沸水上温育10min0(4)将步骤⑶的样品冷却至室温，离心数秒，然后于管中加入TaKaRarTaq酶0・25ul。(5)按以下条件进行PCR反应：94°C预变性3min；然后进行30个循环反应，其温度循环条件为：94°C变性lmin,57°C退火lmin,72°C延伸lmin；循环结束后72°C再延伸5mino(6)取5UIPCR产物在1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测。方案二质粒PCR1.碱裂解法少量

6、制备质粒DNA(1)用离心管收集4ml在LB培养基(含Amp)中培养过夜的菌液，14000rpm离心30秒，弃尽上清。(1)用250uI己加入RNaseAl的BufferS1充分悬浮细菌沉淀。(2)加入250UlBufferS2,温和但充分地上下翻转混合4・6次，此步骤不宜超过5mino*BufferS2使用后应立即盖紧瓶盖，以免空气中的CO2中和BufferS2中的NaOH,降低溶菌效率。(4)加入400ulBufferS3,温和地上下翻转8・10次，室温静置2min,14000rpm离心10mino*若离心后凝结

7、块未沉淀到离心管底部，应再上下翻转数次，12000g离心3mino(1)将DNA-prepTube置于2-mlMicrofugeTube中，将步⑷中的混合液移入DNA-prepTube中，5500rpm离心Imino(2)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube加入500PlBufferWl,5500rpm离心lmin0(3)弃滤液,将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，加入700ul己加无水乙醇的BufferW2,5500rpm离心lmin,以同

8、样的方法再用700ul已加无水乙醇的BufferW2洗涤一次。(4)弃滤液，将DNA-prepTube置回到原2-mlMicrofugeTube中，14000rpm离心lmin。