大肠杆菌表达系统的研究

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1、大肠杆菌表达系统的研究大肠杆菌表达系统是基因表达技术小发展最早，H前应用最广泛的经典表达系统。大肠杆菌表达系统的发展历史可追溯到二十年前，Struhl等(1976)、Vapnek等(1977)和Chang等(1978)分别将酿酒酵母DNA片段、粗糙链抱霉DNA片段和哺乳动物cDNA片段导入大肠杆菌，引起其表型的改变，证明了外源基因在大肠杆菌屮可以使现有功能的活性表达。这些研究工作为大肠杆菌表达系统的发展奠定了理论基础。Guarante等(1980)在Science杂志上发表了以质粒、乳糖操纵了为基础建立起来的大肠杆菌表达系

2、统，这一发展构成了大肠杆菌系统的雏型。随着80年代后期分子生物学技术的不断发展，人肠杆菌农达系统也不断得到发展和完善。与其它表达系统相比，大肠杆菌表达系统具有遗传背景清楚，口的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点。在基因表达技术中占有重要的地位，是分了生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重耍工具。1表达载体大肠杆菌质粒是一类独立于染色体外口主复制的双链、闭环DNA分了，大肠杆菌质粒可分为结合转移型和非结合转移型两种，非结合转移型质粒在通常培养条件下不在宿主间转移，整合到染色休上的频率也很低，具有遗传学上的稳定性

3、和安全性。又因其大小一般在2-50kb范围内，适合于制备和重组DNA的体外操作,因此儿乎所有的大肠杆菌表达系统都选用非结合转移型质粒作为运载外源基因的载体，这些表达载体通过对天然质粒的改造获得。理想的大肠杆菌表达载体要求具有以下特征：(1)稳定的遗传复制、传代能力，在无选择压力下能存在于大肠杆菌细胞内。(2)具有显性的转化筛选标记。(3)启动子的转录是可以调控的，抑制时木底转录水平较低。(4)启动了的转录的niRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制。(5)具备适用于外源基因插入的酶切位点。复制子、筛选标志

4、、启动子、终止子和核糖体结合位点是构成表达载体的最基本元件。2各种类型表达系统的构成及特点一个完整的大肠杆菌表达系统至少要有表达载体和宿主菌两部分构成。为了改善表达系统的性能和对各类外源基因的适应能力，表达系统冇时还需要冇特定功能基因的质粒或溶源化噬箧体参与。到目前为止已经成功发展了许多表达载体和相应的宿主菌。Lac和Tac表达系统这是最早建立并得到广泛应用的表达系统，它是以人肠杆菌lac操纵子调控机理为基础设计、构建的表达系统。Lac操纵子具冇多顺反子的结构。在无诱导物的情况下，负调节因子lacl基因产物与启动子下游的操

5、作基因紧密结合，组织转录的起始。在诱导剂1PTG存在的情况下，与阻遏蛋白结合后，导致与操纵基因的结合能力降低而解离出來，lac操纵子的转录因此被激活。用tac启动子构建的表达系统称为Tac表达系统。为了能使Lac和Tac表达系统具冇严谨调控，一种能产生过量的lad阻遏蛋白的lad基因的突变体lacTq被应用于农达系统(Das1990)o但在使用高拷贝复制子构建表达载体时，仍能观察到较高水平的本底转录，还需在表达载体中插入bclq基因以保证有较多的lad阻遏蛋白产生。目前不少商品化的表达载体都是在Lac和Tac表达系统基础上

6、加以改进和发展的。Lac和Tac表达系统用TPTG诱导转录，但rflTTPTG本身具有一定的毒性，从安全角度而言对表达和制备用于医疗目的的重组蛋白并不适合，一些国家也规定在生产人用的重组蛋白的生产工艺中不能使用TPTG,于是人们想到用阻遏蛋白lacl的温度敏感突变株lacl(ts)应用于Lac和Tac表达系统(HasanandSzybalski1995,Yabuta等，1995)。这些突变体基因插入表达载体或整合到染色体后,均能使lac,tac启动子的转录受到温度严谨调控，在较低温度(30°C)时抑制，在较高温度(42°C

7、)时开放。还有用乳糖替代IPTG诱导物(Hartsock等,1995；Hsih等，1997)。但其效率受到多种因素的影响和制约,因此乳糖诱导的有效剂量大大高于TPTGo乳糖木身作为一种碳源可以被大肠杆菌代谢利用，较多的乳糖存在也会导致菌体生理及生长特性变化。乳糖代替1PTG作为诱导剂的研究要与发酵工艺结合起來，才能显示其良好的前景。PL和PR表达系统以入噬箧体早期转录启动了PL、PR为核心构建的表达系统称为PL和PR表达系统。启动子PL、PR具有很强的启动转录能力，利用它们來构建表达载体并控制外源基因的表达在大肠杆菌表达系

8、统发展初期就己被提出来并加以研究。这两种表达系统利用温度敏感突变体cT857的基因产物來调控PL、PR启动子的转录，它在较低温度(30°C)时以活性形式存在，在较高温度(42°C)时失活。这种表达载体在普通大肠杆菌中相当不稳定，这是因为菌体中没有cl基I大I产物，PL或PR启动子的高强度直接转录所导致。