大肠杆菌表达系统的研究进展综述

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1、基因工程制药综述班级：生技132姓名：学号：大肠杆菌表达系统的研究进展综述自上世纪70年代以来，大肠杆菌一直是基因工程中应用最为广泛的表达系统。尽管基因工程表达系统已经从大肠杆菌扩大到酵母、昆虫、植物及哺乳动物细胞，并且近年来岀现了很多新型的真核表达系统，但是大肠杆菌仍然是基因表达的重要工具。尤其是进入后基因组时代以来，有关蛋白结构以及功能研究的开展，对基因表达的要求更高，这时大肠杆菌往往是表达的第一选择。文章综述了近年来有关大肠杆菌表达载体及宿主细胞的改造工作。1表达载体1.1表达调控构建有效的表达载体是表达目的基因的基本要求，同时也是影响基因表达

2、水平以及蛋白活性的重要因素。标准的大肠杆菌表达载体的主要组成：启动子、操纵子、核糖体结合位点、翻译起始区、多克隆位点、终止子、复制起点以及抗性筛选因子等。理想的表达载体要求在转录和翻译水平上可以控制目的基因的表达，然而目的基因在宿主体内过分表达（选用较强的启动子等）会对宿主造成压力，引起相关的细胞应答反应，影响蛋白的活性等。基因组、RNA转录组、蛋白质组、代谢调控组等领域的研究成果给我们提供了大量关于基因表[1]达调控的信息。现已能从基因和细胞的整体水平来方便地选择合适的启动子或合理开发新的载体系统。譬如Lee等利用二维凝胶电泳法比较了重组载体和空载

3、体被分别转入宿主细胞后蛋白组学的差异，发现两者都产生了大肠杆菌热休克蛋白并引起了cAMPCRP调节蛋白的应答，其中重组子的影响更为强烈；另外，还发现外源基因的表达使宿主核糖体合成速【2]率、翻译延长因子和折叠酶表达水平、细胞生长率下降，而使细胞呼吸活力上升o目前应用的表达载体主要问题是表达过程中出现的全或无的情况，通常表达的培养物都是非纯种的细胞群，其中有一些细胞可以最大限度地被诱导，而另一些细胞在诱导后基因的表达被关闭。分离具有合适强度启动子及翻译速率的载体变种可以优化表达水平，说明启动子的选择对于基因的诱导表达非常重要。Deborahat提出在芯

4、片上排列具有不同强度级别启动[3]子的载体进行互补分析，可能有助于筛选最为适合的启动子。开发非IPTG或阿拉伯糖诱导的载体也可以提高基因表达水平，Qing等利用cspA基因的独特性开发了一系列冷休克表达载体pCold,使目的基因在低温下（＜45°C）诱导表达，提高了产物的溶解性和稳定性[4]O1.2融合表达载体除了表达载体的调控性，为了提高蛋白产物的活性以及简化下游纯化的操作等，往往在表达载体上插入其它辅助的基因序列与目的基因构成融合蛋白表达。融合信号肽（PelB、OmpA、MalE、PhoA等）表达可以使融合蛋白通过经典的Sec途径分泌到周质或胞外

5、表达，有利于形成二硫键以及避免胞质蛋白酶的水解和N端甲硫氨酸的延伸。另外，最近开发的双精氨酸转运体系仃at）可以有效分泌正确折叠的重组蛋白o常见的纯化标签多根据亲和层析的配体来选择，如6His、GST、CAT、MBP等经过一步亲和纯化可以得到均一性较高的产物，但化学洗脱会对产物的活性产生一定的影响。Ca2+依赖的钙调蛋白结合肽（CBP）和链球菌亲和素结合肽（SBP）作为纯化标签时，只需要在洗脱液中移去标签依赖的离子或小分子[6.7]就能实现温和的特异性洗脱O再者，应用一些非层析的纯化标签在纯化操作中非常经济实用，如热敏型的类弹性蛋白多肽（ELPs）可

6、以使蛋白产物在溶解态和非溶解态之间转变[8]后续应用逆转循环的纯化方法可以达到亲和纯化的回收率0另外，在纯化标签与目的蛋白之间插入一些特殊的短肽，同时融合剪切酶可以在纯化操作中利用标签的自剪切直接得到产物蛋白。例如SrtAc酶所识别的短肽序列GTEPL,在蛋白N端依次连接短肽、剪切酶、6His融合表达，亲和上柱后剪切酶发挥作用使N端带有Gly的目的蛋白从融合状态中释放出来[9]3、O噬菌体展示库是表达抗体或其它蛋白库的重要克隆技术，与之相似将目的基因同适合的锚定序列融合可以使产物蛋白表达到大肠杆菌的表面。大肠杆菌展示所用的融合配体一般为细菌的膜蛋白或

7、跨膜转运体，如PadL是大肠杆菌长链脂肪酸的一种外膜转运体蛋白,N端融合PadL表达胞内酶，以全细胞的形式催化反应表现岀非常高的稳定性㈣；Yang等利用恶臭假单胞菌Pseudomonasputida外膜酯酶EstA的转运结构域作为表达胞内■内酰胺酶的锚定基序ini,结果表明蛋白展示在细胞膜外并没有影响细胞的活力1.3共表达载体很多真核基因表达的产物都必须以多聚复合体的形式组合才能表现出相应的活性，因此在表达这一类目的基因的时候常构建共表达载体，另外共表达的策略在辅助新生蛋白质的折叠和分泌中也很有意义。Dzinenu等针对表达异源二聚体构建了口」以同p

8、ET载体共表达的载体pOKD，这种载体含有p15A复制起点，所以可以和大多数大肠杆菌表达载体共[12]存于细