质粒提取和PCR样品纯化

质粒提取和PCR样品纯化

ID:44150527

大小:1.15 MB

页数:22页

时间:2019-10-19

质粒提取和PCR样品纯化_第1页
质粒提取和PCR样品纯化_第2页
质粒提取和PCR样品纯化_第3页
质粒提取和PCR样品纯化_第4页
质粒提取和PCR样品纯化_第5页
资源描述:

《质粒提取和PCR样品纯化》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在行业资料-天天文库

1、质粒提取和PCR样品纯化王忠杰2021/7/201质粒的提取(D/E/F)PCR样品的处理(A/B/C)2021/7/202细菌生长各阶段的特点2021/7/203两种培养基的比较TB2xYT营养成分/LTryptone          12gYeastExtract    24g  Glycerol            4mL磷酸盐缓冲液Tryptone         16g YeastExtract       10g   NaCl主要特征菌液达到稳定期时间短。对含低拷贝质粒细菌的培养非常有利。简要分析1.C/N比对菌液生长的影响,偏高,菌体生长迅速,低拷贝质粒

2、的复制速度可能赶不上宿主的复制速度。2.TB培养基细菌生长速度快,大大的节省了菌液培养时间。2021/7/204质粒提取(碱裂解法)此方法适用于小量质粒DNA的提取,提取的质粒DNA可直接用于酶切、PCR扩增、测序分析。由于操作原因,提取的质粒可有三种结构:复性中间体、开环、闭环超螺旋。2021/7/205质粒提取的思路三个基本步骤:细菌的生长菌体的收集裂解及质粒DNA的分离质粒DNA的纯化要去除的物质:蛋白基因组DNA脂类及小分子杂质RNA2021/7/206溶液I葡萄糖Tris·Cl(pH8.0)EDTA(pH8.0)高压下蒸汽灭菌15分钟,保存于4℃。加入RNase

3、。作用:调节菌体细胞渗透压,分散菌体,给予溶液II更大的作用空间。鳌合金属离子。2021/7/207溶液IINaOHSDS作用:裂解菌体,使核酸和蛋白质变性。2021/7/208溶液III乙酸钾乙酸作用:中和溶液II,质粒DNA复性,变性蛋白-SDS-基因组DNA-K盐的溶解度比其Na盐更低,有利于蛋白混合物的沉淀。2021/7/209质粒提取操作流程接菌振荡培养过夜离心,收集菌体溶液I悬浮菌体(充分振荡)加入溶液II(涡旋振荡)加入溶液III(涡旋振荡)2021/7/2010冰浴水浴冰浴(以上三步主要是为了更好的沉淀蛋白等杂质)离心聚集蛋白、基因组DN

4、A等转移上清至滤板中离心收集上清2021/7/2011加入异丙醇,颠倒混匀,离心沉淀DNA.弃上清,加70%乙醇,离心.弃上清,真空干燥.加ddH2O溶解,振荡,离心.电泳鉴定,定量,系统录入2021/7/2012原因分析:空载体。同种载体相同插入片段,出现大小明显偏小的条带。结果分析2021/7/2013质粒提取过程中常见问题分析1.加入P1后,菌液悬浮困难.2.加完P1后发现没保菌。3.加完P3后发现没加P2.4.在同一排样品中加入了多份的P1,P2,P3.5.吸上清时样品出现问题(2排样品吸在一排里面,吸入过多的蛋白)6.高板离心时缺口未朝内,板子离碎

5、。7.离心完个别孔无样品。8.离心完上清直接倒掉。9.胶垫未盖紧,样品出现串孔。10.异丙醇沉淀时,未注意离心已停止(不知停了多久)2021/7/2014PCR类样品操作流程核对样品信息电泳,切胶PCR样品纯化定量稀释,系统录入2021/7/2015PCR样品纯化具体步骤核对样品离心混匀→→→鉴定电泳大孔胶电泳条带单一直接纯化切胶3倍体积PCR-A,混匀500ulDE-A溶胶6min左右250ulDE-B+150ul异丙醇混匀2021/7/2016转移对应柱子离心1min,弃废液500ulW11min弃废液700ulW2(已按要求加入乙醇)1min

6、,弃废液重复一次(B类样品第2遍400ul)空离2min真空干燥10min35ul已预热或者ddH2O样转,电泳与第一遍电泳核对,定量,离心,填系统2021/7/2017定量稀释根据与marker(D2000)对比片段大小,条带亮度进行定量并加TE或者ddH20稀释,如下图片段大小定量浓度100-2500.5250-5002500-100041000-200062000以上102021/7/2018PCR样品实验中经常出现问题B类样品转C不严格第一遍电泳无条带未跑第二遍复核预检代码错误未达到要求的安排上测序样品质量不好,需试测的未试测预检填错实验中,偶尔出

7、现试剂混加(如W1与PCR-A)、漏加(漏加W1,W2中未加乙醇)信息不全或有问题样品需跟下一个班次或客服交接好2021/7/2019实验收尾工作问题样品的操作记录,交接实验室清洁实验室消毒2021/7/2020优秀员工必须具备素质心态要平和注重细节复核必不可少2021/7/2021谢谢!2021/7/2022

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文

此文档下载收益归作者所有

当前文档最多预览五页,下载文档查看全文
温馨提示:
1. 部分包含数学公式或PPT动画的文件,查看预览时可能会显示错乱或异常,文件下载后无此问题,请放心下载。
2. 本文档由用户上传,版权归属用户,天天文库负责整理代发布。如果您对本文档版权有争议请及时联系客服。
3. 下载前请仔细阅读文档内容,确认文档内容符合您的需求后进行下载,若出现内容与标题不符可向本站投诉处理。
4. 下载文档时可能由于网络波动等原因无法下载或下载错误,付费完成后未能成功下载的用户请联系客服处理。