piwil2诱导3t3细胞恶性转化的分子机制分析

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1、英文缩略表(abbreviations)英文缩写英文全名中文全名bpbasepair碱基对cDNAcomplementaryDNA互补DNACINcendcalintraepithelialneoplasia宫颈上皮内瘤变CSCcancerstemcells肿瘤干细胞CTAcancer-testisantigen肿瘤睾丸抗原DNADeoxyribonucleicacid脱氧核糖核酸HR-HPVHigh-riskhumanpapillomavirus高危型人乳头瘤病毒miRNAMicroRNA微小R

2、NAmRNAMessageribonucleicacid信使核糖核酸PBSphosphate-bufferedsaline磷酸缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应pCSCprecancerstemcell癌前干细胞piRNAPiwi-interactingRNA与Piwi蛋白相作用的RNARISCRNA-inducedsilencingcomplexRNA诱导沉默复合体SDSsodiumdodecylsulphate十二烷基磺酸钠siRNASmallinterfe

3、ringRNA小干扰RNATEMEDTetramethylethylenediamine四甲基二乙胺WBWesternblot免疫印迹Piwil2诱导3T3细胞恶性转化的分子机制研究中文摘要研究背景Piwil2属于Argonaute蛋白家族，是水母、小鼠和人类等不同生物干细胞自我更新均需要的一类基因。Piwil2在正常人体仅在睾丸和造血干细胞有表达，但在很多肿瘤组织和肿瘤细胞株均有表达。Chenetall，J证实，肿瘤干细胞(CSC)和肿瘤干细胞前体细胞(pCSC)特界表达Piwil2蛋白，是干细

4、胞分裂中的重要的调控基因，在干细胞的分化和肿瘤形成和发展屮起着重要的作用，肿瘤组织及肿瘤细胞株Piwil2的阳性表达是由于pCSC/CSC存在的缘故。我们的研究也显示，子宫颈癌干细胞特异表达Piwil2l2J,且宫颈癌组织也高表达Piwil2,上皮内瘤变(cervicalintraepithelialneoplasia,CIN)II/III可见少量表达,而CINI和正常宫颈上皮未见Piwil2表达。因此，Piwil2作为一种肿瘤睾丸抗原(cance.testisantigen,CTA),为肿瘤诱导

5、分化治疗提供了高度特异的作用靶点。目的观察Piwil2对3T3细胞生物学行为的调控作用，并深入探讨其分子机制。方法1.构建PTRES2-EGFP-Piwil2真核表达重组质粒。2.利用Lipofectamine2000将pIRES2-EGFP-Piwil2质粒转入3T3细胞，经过G418筛选，建立稳转细胞株3T3-Piwil2细胞。3.利用细胞集落形成实验观察Piwil2对3T3细胞集落形成能力的影响。4.采用细胞直接计数方法观察Piwil2对3T3细胞的增殖能力的影响。5.利用FACS技术分析P

6、iwil2对3T3细胞周期的调控作用。6.利用Westernblot检测Piwil2下游相关基因:stat3Bcl2cyclinDl等1.利用裸鼠成瘤实验，观察高表达Piwil2基因后对3T3细胞成瘤能力的影响。结果1.成功构建pIRES2-EGFP-Piwil2真核表达重组质粒。2.建立稳定表达Piwil2基因的3T3-Piwil2细胞，空载体转染细胞3T3-EGFP细胞。3.与3T3-EGFP细胞相比，高表达Piwil2基因的3T3-Piwil2细胞集落形成能力增强，组间差异有统计学意义（

7、卩<0・05）。4.与3T3-EGFP细胞相比，高表达Piwil2基因的3T3细胞增殖能力增强，组间差界有统计学意义（°<0.05）。5.细胞周期结果显示，与3T3-EGFP细胞相比，3T3-Piwil2细胞G0/G1期比例下降，S期比例显著升高，组间差异有统计学意义（/9<0.05）o6.Westernblot结果显示了Piwil2的高表达可以激活Stat3/Bcl-2并且增强Stat/cyclinD1的信号通路。7.3T3-Piwil2细胞裸鼠体内成瘤能力增强，肿瘤体积显著大于对照组，组间差异

8、有统计学意义（卩<0・05）。结论1.Piwil2诱导3T3细胞发生恶性转化;2.确定通过激活Stat3增强cyclinD1的信号通路加速细胞分裂以及影响P53失活,上调BCL-2基因，抑制凋亡而发挥分子作用的机制［关键词］Piwil2基因；肿瘤发牛；3T3细胞；基因调控TheResearchofMolecularMechanismofinducingMalignantTransformationof3T3CellsbyPiwil2AbstractBackgroundPiwil2w