pegbpla聚合物胶束的细胞摄取机理研究

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1、独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文屮以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。木人授权华中科技大学可以将木学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索

2、，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密口，在年解密后适用本授权书。本论文属于不保密口。（请在以上方框内打一也）学位论文作者签名:指导教师签名:日期：年月日日期：年月日摘要1Abstract3主要英文缩略语索引51PEG"・PLA聚合物胶束细胞摄取机理研究61.1引言61.2实验部分81.3结果与讨论161.4本章小结262聚合物胶束在细胞内的定位272」前言272.2实验部分272.3结果与讨论282.4本章小结293总结和展望303」全文总结303.2本文的创新之处303.3展望30参考文献31综述33致谢44摘要摘要：

3、纳米技术的进步使得靶向药物传递以及提高药物的稳定性、生物利用度和药物在特定组织中的蓄积成为可能，纳米药物载体作为核昔酸类、蛋口质类等生物大分子药物及小分子化学药物的载体已显示岀良好的发展前景。聚合物胶束作为一种纳米载药系统，由于载药范围广、结构稳定、粒径较小及在体内可以长循环等特性受到人们的广泛关注，用聚合物胶束包载药物以减少药物毒性、提高牛物利用度等成为近年来研究的热点。实验室前期工作用PEG・APLA聚合物胶束包载紫杉醇，发现其有逆转肿瘤细胞多药耐药性的效果，研究其细胞内吞途径发现其进入细胞内是一个浓度、时间、能量依赖性的过程，进一步采用化学

4、抑制剂抑制一些细胞内吞途径的关键分子，发现其可能通过lipidraft/caveolae途径进入细胞，但其具体的机理还不是很清楚，且采用的内吞途径抑制剂可能还存在不特异的问题。本文研究的目的是进一步确定PEGAPLA聚合物胶束进入细胞内的途径及在细胞内的定位，为制备更有效的聚合物胶束纳米载药系统提供理论依据。木文在实验室前期工作的基础上主要开展了以下工作：（1）以荧光染料尼罗红作为模型药物，采用薄膜分散法制备载尼罗红的PEG-&-PLA聚合物胶束。激光粒度仪检测其平均粒径为50.90nm,基本上不带电荷。透射电子显微镜观察其形貌，显示其为具有核•

5、壳结构的球形。（2）用影响内吞途径关键分子dynamin的特异化学抑制剂dynasore处理A2780细胞后，采用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪进行定性和定量检测，发现dynasore能降低细胞内尼罗红的荧光强度，提示dynamin可能参与PEG"・PLA聚合物胶束的内吞途径。为进一步证明dynamin是否参与其内吞途径，采用电转染的方法转染EGFP、dynamin野生型质粒和dynamin显性负突变体K44A至A2780细胞,结果发现转入dynamin野生型质粒的细胞内尼罗红的荧光强度增加，而转入dynamin显性负突变体的细胞内尼罗红荧光强度降

6、低，判定聚合物胶束进入细胞内是dynamin依赖性的。（3）采用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪研究载尼罗红的聚合物胶束在HepG2、Hela.C6细胞的内吞情况，发现C6细胞内尼罗红荧光强度最强，进一步采用RT-PCR检测发现C6细胞内caveolin-1的表达最高，其他两种细胞相对较少，提示caveolin-1可能参与PEG-/?-PLA聚合物胶束的内吞途径。将HepG2和C6细胞分别转染EGFP^caveolin-1野生型和caveolin-1显性负突变体caveolin-1Y14F质粒后，发现HepG2在转染caveolin-1野生型质粒后细

7、胞内尼罗红荧光强度显著增加，而C6细胞转染显性负突变体caveolin-1Y14F后胞内尼罗红荧光强度显著降低，提示PEG-/7-PLA聚合物胶束进入细胞内的途径是caveolin-1依赖性的。(4)为研究clathrin途径是否也参与PEG-&-PLA聚合物胶束的内吞，我们将clathrin野生型质粒转染入A2780细胞内，分别采用激光共聚焦显微镜和流式细胞术定性和定量检测细胞内尼罗红情况，发现转染clathrin野生型质粒的细胞胞内尼罗红荧光强度无明显变化，推测PEGAPLA聚合物胶束不是通过此途径进入细胞内的。(5)为了观察聚合物胶束进入细

8、胞后在细胞内的定位情况，我们分别用溶酶体探针和可分别定位于微管、内质网的质粒转染到A2780细胞内的方法研究聚合物胶束在细胞内的定位，发