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1、Trizol法提取RNA原理：研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNAoRNA质量的高低常常影响cDNA库,RT-PCR和NorthernBlot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氧酸肌等物质，能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。方法：1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min,使其充分裂解。注：此时可放入・70°C长期保持。2、12,000rpm离心5min,弃沉淀。3、按200ul氯仿/mlTrizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15mino注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。4、4°C12
2、,000g离心15mino注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4°C冰箱,若只提RNA,则弃下层酚相。6、按0・5ml异丙醇/mlTrizol加入异丙醇混匀，室温放置5-10mino7、4°C12,000g离心lOmin,弃上清，RNA沉于管底。8、按lml75%乙醇/mlTrizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。9、4°C8,000g离心5min,尽量弃上清。10、室温晾干或真空干燥5-10mino注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。11
3、>可用50ulH20,TEbuffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60oCz5-10mino注：H20、TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。12、测0.D值定量RNA浓度。(注：此方法提取RNAA260/A280值在1.6-1.8X间；产率估计：组织标本：(ugRNA/mg组织)l-10ug,培养细胞(ugRNA/106Cell)：5-15ug)注意事项：组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染；高蛋白、脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4°C12,000g离心l
4、Omin去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；热天提RNA,带手套是必须的，手是RNase的主要来源；组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织剪碎,然后再充分研磨。在使用TRIZOL的时候要带手套和眼罩，避免接触到皮肤和衣服，使用化学通风橱，防止蒸汽吸入。除非特别说明，所有的操作均在15-30°C下进行，所用的试剂均放置于15-30°Co组织在加入氯仿之前是可以在-60—70°C放置一个月。RNA沉淀在75%乙醇中在2-8°C下至少可以放置一周，在-5—-20°C至少可能放置
5、一年。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)试剂:1.5x样品缓冲液(10ml):0.6mllmol/L的Tris-HCI(pH6.8),5ml50%甘油，2ml10%的SDS,0.5ml基乙醇,lml1%漠酚蓝,0.9ml蒸馅水。可在4°C保存数周，或在一20°C保存数月。2.凝胶贮液:在通风橱中，称取丙烯酰胺30g,甲叉双丙烯酰胺0.8g,加重蒸水溶解后，定容到100mlo过滤后置棕色瓶中，4°C保存，一般可放置1个月。3.pH8.9分离胶缓冲液:Tris36.3g,力nlmol/LHCI48ml,加重蒸水80ml使其溶解，调pH8.9,定容至100ml
6、,4°C保存。4.pH6.7浓缩胶缓冲液：Tris5.98g,加lmol/LHCI48ml,加重蒸水80ml使其溶解，调pH6.7,定容至100ml,4°C保存。5.TEMED(四乙基乙二胺)原液640%过硫酸鞍(用重蒸水新鲜配制)7.pH8.3Tris-甘氨酸电极缓冲液：称取Tris6.0g,甘氨酸28.8g,加蒸镭水约900ml,调pH8.3后，用蒸憾水定容至1000mlo置4°C保存,临用前稀释10倍。8.考马斯亮蓝G250染色液：称100mg考马斯亮蓝G250,溶于200ml蒸憾水中，慢慢加入7.5ml70%的过氯酸，最后补足水到250ml,搅拌1小吋，小孔
7、滤纸过滤。器材：电泳仪，电泳槽，水浴锅，摇床。样品处理将蛋白质样品与5X样品缓冲液(20ul+5ul)在一个Eppendorf管中混合。放入100°C加热5-10min,取上清点样。分离胶及浓缩胶的制备与电泳①将玻璃板、样品梳、Spacer用洗涤剂洗净，用ddH2O冲洗数次,再用乙醇擦拭，晾干;②将两块洗净的玻璃板之间加入Spacer,按照Bio-RadMiniII/III说明书提示装好玻璃板；③按如下体积配制10%分离胶8.0ml,混匀：ddH2O3.0ml；1.0mol/LTris-HCIpH=8.82.1ml；30%Acr-Bis2.8ml；10%SDS8
