人血管形成素在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定

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1、!"卷!期生物工程学报%&’(!")&(!#$$!年!月!"#$%&%’()*$+,(-.#(/%0"$(,(12*&+,-./#$$!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!人血管形成素在大肠杆菌中的融合表达、纯化及活性测定杨辉!"张英起!颜真!韩苇!药立波#苏成芝#（!第四军医大学生物技术中心，#第四军医大学生物化学与分子生物学教研室西安"!$$7#）摘要@40AB@获取的血管形成素C+D;&D5+;+?E)C片段，克隆入融合表达载体F@G94H中，表达产物为)端融合了I;J2的融合蛋白，以包

2、涵体形式存在，占菌体总蛋白的!$K。用3:&’／L脲溶解包涵体，利用I;J2与过渡态金属离子);#M高亲合力结合的性质，经);#M0)4C亲和树脂一步法纯化，获得纯度达63K以上I;J20C)N融合蛋白，O5JP5.+0<’&P结果表明在相应分子量处有一条特异性条带。重组蛋白复性后活性测定表明，在体外可促进鸡胚绒毛尿囊膜（BCQ）血管形成，并可降解P@)C。关键词血管形成素，I;J2融合蛋白，配体亲和层析中图分类号@7!3文献标识码C文章编号!$$$07$2!（#$$!）$!0$$880$1肿瘤的发生、发展有赖于新生血管的不断形成，SA4N、10氯乙萘酚为上海生工产品；);#M0)

3、4C人们一直寻找来自肿瘤细胞的介导血管生长的物G5FR-.&J52H为U;-D5+产品；山羊抗人C)N多抗、质，希望其能成为新的肿瘤治疗药物，从而控制肿瘤及辣根酶标记的鼠抗羊的二抗为G-+P-B.,V和北京生长［!］。!638年，首次从人结肠腺癌细胞系I40#6中山公司产品。细胞培养上清中发现了一种能诱导血管形成的物!"$%&’重组质，命名为C+D;&D5+;+（血管形成素，简称C)N）［#］。质粒提取，酶切反应，E)C电泳、回收、连接、转化参照分子克隆实验手册进行［1］。RC)N的发现引起人们极大的兴趣，但从人结肠腺癌I40#6细胞条件培养基中获取RC)N的量，不足!"(外源基因

4、表达及表达产物溶解性分析以供RC)N生理功能、抗原特性及潜在的临床应用构建成功的重组表达质粒F@G940C)N转化宿等方面的研究应用，为获取足够量的RC)N，我们将主菌HL#!E97（FL/GJ），挑取单克隆即为C)N的表RC)N?E)C克隆入带有纯化标签的表达载体达菌株，接种于含C:F（!$$#D／:L）的LH中，次日［7］，便晨，按#K转接，7"W培养7R，加SA4N至终浓度F@G94H，表达的目的蛋白的)端融合有I;J2于利用金属鏊合亲和层析柱对表达产物一步纯化，$X8::&’／L，诱导表达!$8R，!#KGEG0ACN9，电获得有活性的重组蛋白，为探索肿瘤发生、发展中肿泳，

5、以鉴定是否有诱导产物表达。瘤血管形成的意义、机制及相应的拮抗剂的研究打诱导表达菌悬于G49中，加入溶菌酶，1K下基础。ETB，#::&’／LQDB’#，E)-J5%，搅拌片刻，1W下!#$$$.／:;+离心!$:;+，分别取上清和沉淀进行!材料与方法!#KGEG0ACN9。!"!材料!")表达产物的亲和纯化菌种和质粒：表达.RC)N的重组质粒诱导表达菌!D，冰浴，悬于8:L缓冲液H［7］，质粒F@G94H含（3:&’／L脲，$X!:&’／L)-I，$($!:&’／L4.;J(B’F@G940C)N由本实验室构建#AT1有4"启动子的融合表达载体，340(,#HL#!（E97）FI3

6、($），搅拌至清亮，!$$$$DY7$:;+离心，上清FL/GJ含有"溶原的4"@)C聚合酶基因的表达宿即为细菌裂解液，与!:L预先用缓冲液H平衡的主菌。);#M0)4C树脂混合装柱。依次用#Y1:L缓冲液!"#酶和试剂B（3:&’／L脲，$X$!:&’／L)-I#AT1，$X$!:&’／L限制酶，41E)C’;D-J5为NSHBT公司产品；4.;J(B’FI2X7）洗去非特异吸附蛋白，1Y$X8:L收稿日期：#$$$0$10#2，修回日期：#$$$0$30#3。"联系作者。45’：320#6077"18"7；90:-;’：<;&"$"!=::,(5>,(?+生物工程学报)G卷8<

7、缓冲液!（"#$%／&脲，’()#$%／&*+,-./0，’1’)显示，诱导者在分子量)"V!处有一条明显的深染#$%／&234516%7,819）及0:’18#&缓冲液;（"新生蛋白带，与预计,45后有一明显的重组蛋白表达6%7,018），洗脱特异性结合的,45<融合蛋白，收集条带（J4O1)）。诱导表达菌，裂菌，上清和沉淀行洗脱峰。!、;洗脱峰用