蛋白质与生物大分子的相互作用研究

《蛋白质与生物大分子的相互作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、蛋白质与生物大分子的相互作用研究张雪梅apoe@163.com检验医学院基因的功能研究成为热点，研究的对象即为基因编码的产物—蛋白质，生物功能的主要体现者和执行者。在所有生命活动中，细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性，这其中必须涉及蛋白与蛋白、核酸的相互作用。掌握或发明研究相互作用的方法非常重要。nucleuscytoplasm主要内容免疫共沉淀(Co-IP)：蛋白—蛋白，蛋白—DNAPulldown（亲和层析）：蛋白—蛋白，蛋白—DNA/RNA电泳迁移实验(EMSA)：蛋白—DNA/R

2、NA酵母双杂交系统：蛋白—（X）—蛋白用途：鉴定两种目标蛋白质是否在体内结合，结合位点分析；筛选一种特定蛋白质的新的作用搭档。原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质x的抗体免疫沉淀x，那么与x在体内结合的蛋白质y也能沉淀下来。一、免疫共沉淀（invivo）Co-Immunoprecipitation，Co-IPCo-IP工作原理示意图Co-immunoprecipitationbindingwashelutionYYYYYWesternblot鉴定PAGE质谱细菌蛋白质

3、的“proteinA”可特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段Co-IP鉴定蛋白相互作用实验注意事项细胞裂解采用温和的裂解条件（NP40、Triton-X100等）；每种细胞的裂解条件是不一样的，通过经验摸索确定。确保共沉淀的蛋白是由所加入的特异性抗体沉淀得到的，而并非其他非特异蛋白：1、使用单克隆抗体：多抗？2、使用对照样本或抗体（同型抗体）StructuralbasisofGprotein–coupledreceptor–Gproteininteractions。NatureChemBiol,2010,6:541-548（分析蛋白相互作用

4、的位点）大鼠G蛋白耦联受体M3RG蛋白α（绿色）β（蓝色）γ（紫色）亚基G蛋白藕联受体信号转导示意图将不同变异体的表达质粒共转染入cos-7细胞中，单独转染的为对照；左图为IP前的IB,右图为IP后的IB，二者复合物为80kD（阳性结果）。图为两次独立实验的其中一次。TAK-242(Resatorvid),aSmallMoleculeInhibitorofToll-LikeReceptor(TLR)4Signaling,BindsSelectivelytoTLR4andInterfereswithInteractionsbetweenT

5、LR4andItsAdaptorMolecules.MolPharmacol,2011,79:34-41（鉴定）分析靶蛋白与小分子化合物的作用：TheimmunoprecipitateswereseparatedusingSDS-PAGEimmunoblottingwithanti-FLAGM2mAboranti-HAtagmAb.analyzedusingautoradiography.TRAM分析小分子化合物对蛋白相互作用的干扰ScreeningofClpEinteractionproteinsConstructrecombinant

6、plasmidpAE03-ClpEandtransformintoS.pneumoniaeD39WesternblotforidentificationCo-Immunoprecipitation(Co-IP)transfer1ml（OD600=0.5-0.6）clearedlysateofD39andD39-ClpE-GFPtoa10mlbeakerseparately.Add500μlproteinG-agarosebeads(GE),incubatefor3hat4℃onarotatingapparatuswithmagnetics

7、tirrertoremovenon-specificallyboundproteins.Add800μlproteinG-agarosebeadsand20–25μgGFPantibody(Clontech)tothesupernatant.Incubateovernightat4℃onarotatingapparatus.Washbeadsfivetimeswith1mlPBSfor2mineachwash.Resuspendpelletin50-80μl2×SDSsamplebuffer.Load10–15μlofsupernatan

8、tonanSDS/polyacrylamidegel.FtsW与ClpE的相互作用鉴定A：IP前GFP多抗检测1.D39，2.D39（FtsW::GFP)B：IP后ClpE多抗检测1.rClp