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1、·22·微生物学通报2006年33(6)应用流式细胞术检测毕赤酵母的细胞活性3肖安风周祥山周利张元兴(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室上海200237)摘要:选取两种细胞活性染色试剂二乙酸荧光素(fluoresceindiacetate,FDA)和碘化丙锭(propidiumiodide,PI),应用流式细胞术(flowcytometry,FCM)检测毕赤酵母细胞活性。比较FDA/PI双染色与PI单染色的FCM图谱,后者能够很好地将死活细胞区分开来并得到正确的比例。利用PI单染色检测发酵过程细胞活
2、性的变化,甘油补料阶段几乎没有细胞死亡,进入甲醇补料阶段后,随着细胞密度的增加,细胞的活性不断降低,发酵88h时细胞活性仅为7318%。关键词:流式细胞术,检测,毕赤酵母,细胞活性中图分类号:Q2233文献标识码:A文章编号:025322654(2006)0620022205ApplicationofFlowCytometryinViabilityDetectionofPichiapastorisCells3XIAOAn2FengZHOUXiang2ShanZHOULiZHANGYuan2Xing(Sta
3、teKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai200237)Abstract:CellviabilityofPichiapastoriswasdetectedbyflowcytometry(FCM)withtworeagentsfluoresceindiacetate(FDA)andpropidiumiodide(PI)1ComparedwithFDA/PIdouble2st
4、aineddotplotsandPIsingle2staineddotplots,thelattercoulddividedeadandlivingcellsintotwoseparatezones,andgetthecorrectpro2portion1ThenPIsingle2stainedmethodwasusedtodetectthechangeofcellviabilityinPichiapatorisfermenta2tion1Atglycerolbatchandfed2batchphase,
5、littledeadcellsweredetected1Atmethanolfed2batchphase,cellviabilitydecreasedwhencellweightincreased,andwasonly7318%at88h1Keywords:Flowcytometry,Detection,Pichiapastoris,Cellviability[1]毕赤酵母作为一种优秀的真核表达系统,得到了广泛的应用。然而,温度、pH、[2]饥饿等多种压力因素会使酵母细胞的活性降低甚至自溶,影响外源蛋白的
6、产量,因此,建立简便、快速的细胞活性检测方法对毕赤酵母发酵生产具有实际意义。[3][4]目前检测酵母细胞活性的常规方法有菌落计数法、美蓝染色法、比氧消耗速[5]率检测法等,这些方法均具有操作复杂、检测灵敏度差和耗时等缺点。近年来,流式细胞术(flowcytometry,FCM)作为一种有效的且有价值的方法常常用来替代常规方[6]法检测微生物活性。流式细胞仪可以一次性检测细胞群体中的几千个细胞,使研究人员建立个体细胞在群体中的多维表象,自动化程度高,每次检测能获得非常大的信息量。流式细胞技术在动物细胞的周期
7、分析中得到了大量的应用,然而,该技术在毕赤酵母细胞检测方面的报道还比较少,处于研究阶段。本文选取了FDA和PI两种荧光染料,利用流式细胞仪检测酵母的细胞活性,将其与美蓝染色法进行比较,最后利用流式细胞仪对毕赤酵母发酵过程的细胞活性进行检测。3通讯作者Tel:021264253025,E2mail:yxzhang@ecust1edu1cn收稿日期:2006201215,修回日期:20062032222006年33(6)微生物学通报·23·1材料与方法111菌株与培养基[7]表达重组水蛭素(rHV22Lys4
8、7)的毕赤酵母基因工程菌,由山东东阿阿胶股份有限公司提供。种子培养基、发酵培养基和补料培养基见文献[7]。112仪器与试剂FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)。碘化丙锭(PI)溶液:1mgPI溶于1mL去离子水中,4℃避光保存。二乙酸荧光素(FDA)溶液:5mgFDA溶于1mL丙酮中,4℃避光保存。美蓝染色液:美蓝011g/L,柠檬酸钠20g/L。113细胞培养5种子培养:2L三角瓶中装入500mL种子培养基,1×
