荧光素标记原理

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1、碱性磷酸酶标记的链霉亲和素－生物素法（SAP法）免疫组织化学实验二实验材料1、小鼠胰腺的石蜡切片；2、胰岛素抗体（鼠抗人单克隆抗体）；3、SAP检测试剂盒；4、正常羊血清；5、0.01MPBS（pH7.2～7.6）；6、BCIP/NBT显色试剂；7、孵育湿盒。实验原理ABC法SAP法实验方法或步骤1、石蜡切片脱蜡至水，蒸馏水洗，PBS浸泡2min；(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。2、10％正常羊血清封闭，室温孵育10min；3、倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的胰岛素一抗或一抗工作液，37℃孵育45min。PBS冲洗，3×3min；4、滴加生物素标

2、记羊抗鼠IgG工作液，37℃孵育20min；5、PBS冲洗，3×3min；6、滴加碱性磷酸酶标记链霉亲和素工作液，37℃或室温孵育20min。PBS冲洗，3×3min；7、显色剂显色（BCIP/NBT）；8、自来水充分冲洗，封片。结果胰岛内可见蓝色或紫蓝色着色的阳性细胞，阳性产物见于细胞质多聚鳌合物酶法HRP---多聚化合物---抗体一、Epos法Enhancedpolymerone-stepstaining组织抗原一抗HRP多聚化合物骨架EPOS方法原理：采用一种具有惰性的多聚化合物作为骨架，将特异性抗体和HRP，同时标记在多聚合物分子上，形成HRP-

3、--多聚化合物---特异性抗体。步骤：一步法特点：快速，简便，特异性强，敏感性高但商品化种类不全，价格昂贵二、EnVision法（或PowerVison）EnhancedLabelledPolymerSystem原理：HRP---多聚化合物---第二抗体组织抗原一抗二抗酶多聚化合物骨架第一步第二步PowerVision方法特点：敏感性高：（每个多聚鳌合物中含70个HRP分子和10个第二抗体）特异性强：复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。基本操作步骤1.抗原修复2.内源性过氧化物抑制3.正常血清封闭4.第一抗体5.多聚骨架复合物6.显色实验步

4、骤1、石蜡切片脱蜡至水，PBS洗3×3min；2、3%H2O2室温孵育10min，以消除内源性过氧化物酶的活性；蒸馏水洗，PBS浸泡5min；3、滴加适当比例稀释的胰岛素一抗工作液，37℃孵育1hr；4、PBS冲洗，3×3min；5、滴加HRP标记羊抗小鼠Ig多聚体，37℃或室温孵育20～30min；6、PBS冲洗，3×3min；7、显色剂显色（AEC或DAB）；8、自来水充分冲洗，封片。结果：胰岛内可见棕色着色的阳性细胞，阳性产物见于细胞质。