荧光素标记抗体技术

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1、荧光素标记抗体技术(一)　原理目前用于抗体标记的荧光素主要有异硫氰酸荧光素(Fluoresceinisothiocynate,FITC)或罗达明(LissaminerhodamineB200,RB200)。在硷性条件下FITC的碳酰胺键可与抗体赖氨酸的ε氨基共价结合，标记后的抗体仍保持与相应抗原结合的能力。在荧光灯源紫外线或兰紫光激发下产生黄绿色荧光，通过在荧光显微镜下观察或流式细胞仪分析可对相应抗原进行定性、定位或定量的检测。(二)　操作步骤　　　　将纯化的IgG抗体对PH9～9.5碳酸盐缓冲液透析过夜，　　　　透析

2、后抗体液移入小烧杯中　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　称取适量IFTC，加入二甲亚砜(DMSO)(FITC～1mg/1mlDMSO)　　　　使终浓度为1mgFITC／1mlDMSO　　　　FITC／IgG比例:如IgG浓度为1mg／ml，FITC／IgG比例约为50μgFITC／mgIgG；　　　　如IgG为5～10mg／ml，则比例为25μgFITC／mlIgG　　　　在10ml小烧杯中先放入抗体　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　按上述比例将FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗体溶液中　　　　　　　　　　

3、　↓　　　　将标记物用PBS加至2.5ml，磁力搅拌器室温下避光搅拌2h　　　　　　　　　　　↓　　　　用PD10柱(SephadexG25柱)除去游离荧光素，先用25mlPBS淋洗G25柱　　　　　　　　　　　↓　　　　收集PBS洗脱第一个荧光素结合蛋白峰，测定F／P　　　　比值。第二个荧光素峰为游离荧光素　　　　计算:　　　　　　　　　2.87×A495　　　　F／P＝────────　　　　　　　　A280-0.35×A495　　　　合适的F／P值为2～4。(三)　试剂器材　　1.　纯化的多克隆抗体或单克隆抗体。

4、　　2.　FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它荧光色素。　　3.　PBS、DMSO　　4.　PH9～9.5碳酸盐缓冲液:Na2CO34.3g，NaHCO38.6g加蒸馏水至500ml。　　5.　PD10柱(SephadexG25柱)6.磁力搅拌器，紫外分光光度计等(四)　注意事项　　1.　FITC保存于4℃暗处，使用前待试剂瓶升至室温时开盖称取，以避免潮解。　　2.　FITC-DMSO液要临用时配制。　　3.　碳酸盐缓冲液要新鲜配制。