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1、⑴荧光抗体技术抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。免疫荧光⑵免疫荧光测定抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法⑴荧光物质1)荧光色素许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。常用的荧光色素有：⑴异硫氧酸荧光素(fluoresceinisothiocyanate,FITC)为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4,最大吸收光波长为490-495nm,最大发射光波长520-530nm,呈现明亮的黄绿色荧光，结构式如下：有两种
2、同分异结构，其中异构体I型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好,在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：①人眼对黄绿色较为敏感，②通常切片标本中的绿色荧光少于红色。⑵四乙基罗丹明(rhodamine,RIB200)为橘红色粉末，不溶于水，易溶于洒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。结构式如下：最大吸收光波长为570nm,最大发射光波长为595〜600nm,呈橘红色荧光。⑶四甲基异硫氤酸罗丹明(tetramethylrhodamineisothiocyanate,TRITC)结构式如下:最大吸引光波长为550nm,最大发射光波长为620nm,呈橙红色荧光
3、。与FITC的翠绿色荧光对比鲜明，可配合用于双重标记或对比染色。其异硫氧基可与蛋白质结合，但荧光效率较低。⑵其他荧光物质1)酶作用后产生荧光的物质某些化合物本身无荧光效应，一旦经酶作用便形成具有强荧光的物质。例如4•甲基伞酮・0・D半乳糖甘受B•半乳糖昔酶的作用分解成4■甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波反为360nm,发射光波氏为450nm。其他如碱性酸酶的底物4・甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对疑基苯乙酸等。1)澜系螯合物某些3价稀土匍系元素如術(Eu3)、轼(Tb3)、肺(Ce3)等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3应用最广。Eu3螯合物的激发光波
4、长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合用于分辨荧光免疫测定。免疫荧光常见荧光编辑免疫荧光荧光素1)FITC2)RB2003)TRITC4)鋼系：Eu、Tb5)PE6)其它常见荧光素的特性1)FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm,发射光：520-530nm,明亮的黄绿色荧光。2)RB200：橘红色粉末，吸收光570nm,发射光595~600nm,橘红色荧光。3)TRITC：紫红色粉末，吸收550nm,发射光620nm,橙红色荧光。4)鋼系：Eu、Tb5)PE：吸收光490~560nm,发射光595nm,红色荧光。6)其它：酶作用后产生荧光物质。免疫荧光
5、酶作用生物质酶底物产物激发光发射光B-GMUGMU360450APMUPMU360450HRPHPA二聚体317414⑷合适荧光素的选择1）具有与蛋白质形成共价键的化学基团。荧光素-N=C+NH-蛋白质荧光素-N-C-N-蛋白质IIIIIIISHHSH2）荧光效率高，标记后下降不明显。3）荧光色泽与背景色泽对比鲜明。4）标记后能保持生物学活性和免疫活性5）标记方法简单、快速。6）安全无毒⑴免疫荧光实验步骤编辑免疫荧光直接法测抗原⑴基本原理将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高,非特异性荧光染色少。缺点是敏感性偏低；而且每检查一种抗原就需要制
6、备一种荧光抗体。此法常用于细菌、病毒等微生物的快速检查和肾炎活检、皮肤活检的免疫病理检查。⑵试剂与仪器磷酸盐缓冲盐水（PBS）:0.01mol/L,pH7.4荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L,pH7.4的PBS进行稀释缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9份+pH9.20.2M碳酸盐缓冲液1份配制搪瓷桶三只（内有0.01mol/L,pH7.4的PBS1500ml）有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫）荧光显微镜玻片架滤纸37°C温箱等。⑶实验步骤①滴加0.01mol/L,pH7.4的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。②滴加适当稀释的荧光标记的抗体溶液
7、，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温一定时间（参考：30min）。③取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L,pH7.4的PBS冲洗后，再按顺序过0.01mol/L,pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸3-5min,不时振荡。④取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标木干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆主niLo⑤立即用荧光显微镜观察。观察标木的特异性荧光强度，一般可用“+”表示：（・）无荧光；（士）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮;（+++・・++++）荧光闪亮。待检标本
