荧光标记抗体课件.ppt

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1、荧光抗体标记原理荧光抗体标记技术是将荧光素以化学方法与特异性抗体共价结合，形成荧光素-蛋白质结合物（即荧光标记抗体），此结合物仍保留着抗体活性，同时具有荧光素的示踪作用。当它与相应的抗原特异结合后，借助于荧光显微镜观察呈现明亮的特异荧光。原理实验中常用异硫氰基荧光黄（fluoresceinisothiocyanate,FITC）作为标记物，在碱性溶液中，FITC上的化学基团异硫氰基（-N=C=S）与抗体蛋白自由氨基（主要是赖氨酸的ε-氨基）结合，形成荧光抗体。分子筛层析原理荧光素标记抗体的纯化采

2、用凝胶过滤法，又称分子排阻层析或分子筛层析，是以多孔网状结构凝胶颗粒作为层析介质。每种型号的凝胶颗粒，其所具有的海绵状立体网孔结构的孔径较一致，犹如分子筛一样，可以分离一定大小的分子。当不同大小分子的混合物加至柱表面时，大分子不能进入胶粒的网孔内，在胶粒之间的空隙中向下移动，首先被洗脱；而小分子则在下移的过程中，可不断进入胶粒的网孔内而反复遇阻，下移速度慢，逐渐与大分子分开，因而后被洗脱。本实验根据所提纯的分子大小采用葡聚糖凝胶SephadexG-25，分离荧光素标记抗体与游离荧光素。FITC的

3、标记原理与方法荧光素-N=C=S+NH2-抗体荧光素-N-C-N-抗体HSH（1）荧光抗体的标记作为标记的荧光素应符合以下要求：①应具有能与蛋白质分子形成共价健的化学基团，与蛋白质结合后不易解离，而未结合的色素及其降解产物易于清除。②荧光效率高,与蛋白质结合后，仍能保持较高的荧光效率。③荧光色泽与背景组织的色泽对比鲜明。④与蛋白质结合后不影响蛋白质原有的生化与免疫性质，与蛋白质的结合物稳定，易于保存。⑤标记方法简单、安全无毒。常用于标记的荧光素：异硫氰酸荧光黄（FITC）四乙基罗丹明（RB200

4、）（2）标记抗体的纯化①透析法②层析分离法（3）荧光抗体的鉴定F/P比率：将制备的荧光抗体稀释至A280≈1.0，分别测读A280（蛋白质特异吸收峰）和标记荧光素的特异吸收峰。值越高，说明抗体分子上结合的荧光素越多，标记抗体的灵敏度就高，反之则越少；但F/P过高会增加荧光素标记抗体的负电荷，从而增加与组织细胞的非特异性吸附；一般用于固定标本的荧光抗体以F/P＝1.5为宜，用于活细胞染色的以F/P＝2.4为宜。F/P值取已知浓度的抗体蛋白溶液（1ml，50mg/ml），用pH9.5，0.5M碳酸缓

5、冲液（1.25ml）稀释至最终浓度为20mg/ml。置于包黑纸的小烧杯中，并放入磁棒。称取适量FITC并溶解（已完成）开启搅拌器，将FITC溶液用滴管逐滴滴入含抗体蛋白溶液的烧杯内，加盖搅拌1小时。实验步骤用SephadexG-50装25cm层析柱，凝胶沉积约18cm（离管口7cm，避免凝胶柱干掉），用pH7.0，0.005M磷酸缓冲液（PB）平衡洗脱约10分钟，流速控制为1ml/分钟。吸取上述标记液上凝胶柱，注意不可使柱面干掉。用pH7.0，0.005MPB洗脱，流速控制为1ml/分钟。可看到

6、黄色与黄绿色荧光在凝胶柱分开。实验步骤收集：当黄绿色荧光出现在洗脱液时，用试管收集全部黄绿色荧光溶液。黄色荧光溶液洗脱较慢，用蒸馏水洗脱约15分钟，直至黄色荧光消失，停止洗脱后，将柱内凝胶回收入凝胶瓶内。实验步骤将试管内收集的溶液混匀，作10倍稀释（0.8ml+7.2mlPB）后在紫外分光光度计分别测OD495nm和OD280nm值。计算F/P值，并对该比值作一简单分析。2.87×OD495nmOD280nm－0.35×OD495nm实验步骤F/P=1.影响标记效率的因素有温度、时间、pH、荧光

7、素和蛋白的量等，需注意控制。2.荧光素及其标记抗体的操作过程注意避光，搅拌速度应适当以避免气泡产生。3.层析柱装柱注意正确操作，使柱体均匀、柱面平整，无气泡、裂隙。4.上样和洗脱时应做到“前切”和“后切”。“前切”指柱顶缓冲液与凝胶平面相切时再加样品；“后切”指样品走至与凝胶平面相切时再加入洗脱缓冲液。注意事项