蜗牛酶提取新生隐球菌基因

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1、蜗牛酶提取新生隐球菌基因组一、试剂准备1巯基化合物(0.04MEDTA和0.14Mβ-巯基乙醇)（30ml）：0.5MEDTA2.4ml巯基乙醇（分析纯ρ=1.11439g/ml）294μl无菌水27.3ml在通风橱中操作，将三者加入50ml离心管中，涡旋震荡混匀，用膜封口，4℃保存。2蜗牛酶的溶解：1）1g市售蜗牛酶（用前4℃保存）。2）配置pH5.8的磷酸钾缓冲液（100ml）：1mol/LK2HPO41mol/LKH2PO48.5ml91.5ml3）配置SCPB缓冲液（10ml）：1.82g山梨醇、0.042g柠檬酸钠，用10mlpH5.8磷酸钾缓冲液溶解，涡旋震荡混匀，在超净台中

2、，滤器过滤除菌，4℃保存。4）超净台中，将5mlSCPB缓冲液加入到装有1g蜗牛酶的棕色瓶中，轻轻摇动混匀，务必使蜗牛酶完全溶解，用之前用枪头挑一下瓶底，看是否有未溶解的酶，若有则继续摇动或用枪头吹吸之溶解。溶解后的蜗牛酶成为200mg/ml的溶液，4℃保存。3SE缓冲液（30ml）：1.5MNaCl3ml；0.5MEDTA（pH8.0）6ml；无菌水21ml。超净台中配置。涡旋混匀，4℃保存。4Ⅱ液（30ml）：0.5MEDTA（pH8.0）1.2ml1MTris-Cl（pH8.0）1.5ml无菌水27.3ml超净台中配置。涡旋混匀，4℃保存。510%SDS（30ml）：30ml无菌水

3、溶解3gSDS，涡旋溶解，无需灭菌，常温静置。65MKAc（30ml）：30ml双蒸水溶解14.73g乙酸钾，高压灭菌，4℃保存，使用前20min置于-20℃冰箱预冷。7氯仿-异戊醇（24:1）（12.5ml）：12ml氯仿与0.5ml异戊醇混合均匀，用膜封口，4℃保存。8异丙醇（-20℃）；70%乙醇（-20℃）；无菌水（4℃）二、实验步骤接菌环挑取一环菌体，接种于液体SDA培养基中，37℃，200转摇培48-72h，准备菌液。实验前准备32℃、65℃水浴和冰盒。1、3-5ml菌液分次加入1.5ml离心管中，室温10000rpm离心1min，弃上清。2、200μl无菌水洗涤菌体（吹吸重

4、悬），室温10000rpm离心1min，弃上清。3、重复步骤2一两次4、用巯基化合物预处理菌体，以提高蜗牛酶作用效果：菌体悬于300-500μl巯基化合物中，32℃水浴15-30min。期间轻轻颠倒离心管两三次。5、室温10000rpm离心1min，弃上清。6、用500μlSCPB缓冲液悬浮菌体，加入100μl蜗牛酶溶液，32℃水浴40min，期间轻轻颠倒离心管五六次。7、室温13000rpm离心2min，弃上清。8、500μlSE液洗涤沉淀，将其吹打悬浮，室温10000rpm离心1min，弃上清。9、重复步骤8五六次。10、加500μlⅡ液和50μl10%SDS，吹打混匀，65℃水浴3

5、0min，期间轻轻颠倒离心管两三次。11、加200μl5MKAc溶液，冰浴30min。12、4℃，12000rpm离心15min。将上清转移新离心管中，计量上清体积。13、加等体积氯仿-异戊醇，剧烈震荡，4℃，6000rpm离心10min，将上清转移至新离心管中。14、重复步骤13一次，计量上清体积。加等体积冷异丙醇，-20度静置10min15、4℃，13000rpm离心10min，弃上清，此时管底应有白色沉淀，用70%冷乙醇洗涤沉淀2-3次，尽去残液，室温晾干沉淀。16、30-50μl无菌水溶解沉淀，-20℃保存。