基因工程-第二章--基因克隆所需的工具酶

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1、2021/10/3苏州科技学院生物系叶亚新第二章基因克隆所需的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等2021/10/3苏州科技学院生物系叶亚新天然DNA的来源染色体DNA、病毒和噬菌体DNA、质粒DNA、线粒体和叶绿体DNA天然DNA的提取准备生物材料裂解细胞分离和抽提DNA第二节天然DN

2、A的制备2021/10/3苏州科技学院生物系叶亚新限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列．并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶一.限制性内切酶的发现1.细菌限制修饰系统的发现WernerArber于1962-1968年发现，1968年分离到I型限制酶。2.限制酶HindII的发现H．O．Smith和Wilox于1970年首次从流感嗜血杆菌（H.influenzae）中发现并分离到HindII限制酶。3.SV40限制图谱和转录图谱的绘制D.Nathans（1971年）

3、用HindII绘制SV40的限制酶谱。第三节限制性核酸内切酶和DNA片断化2021/10/3苏州科技学院生物系叶亚新1.I型：由三个基因构成，hsdR；hsdM；hsdS（hostspecificityforDNArestrictionmodificationandspecificity）位于染色体上，三个基因构成一个复合体，限制酶需要ATP、Mg2+、SAM（５—腺苷甲硫氨酸）。2.II型：限制与修饰基因产物独立起作用，在Ｅ.coli中这两种基因位于质粒上。3.III型：修饰酶与Ｉ型酶相同，hsdＭ与hsdＳ基因产物结合成一亚单位，限制酶是

4、独立存在的。上述三个系统中，只有II型限制酶与甲基化酶具有相当高的核苷酸识别特异性，因而被广泛用于基因工程中。二、限制修饰系统的种类2021/10/3苏州科技学院生物系叶亚新1.定义：广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II型限制酶。2.命名：限制酶由三部分构成，即细菌种属名、菌系编号、分离顺序。例如：HindⅢ前三个字母来自于菌种名称H.influenzae，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。EcoRI—EscherichiacoliRIHindⅢ—HaemophilusinfluensaedⅢSacI(II)—S

5、treptomycesachromagenesI(Ⅱ)三.限制性内切酶的定义、命名2021/10/3苏州科技学院生物系叶亚新1.识别顺序和酶切位点１）识别４-8个相连的核苷酸MboINGATCN；AvaIIGG(A/T)CCBamHIGGATCC；PpuMIPuGG(A/T)CCPyNotIGCGGCCGC；SfiIGGCCNNNNNGGCCCCGGN’N’N’N’N’CCGGFokI5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’外侧，产生５’-端突起２）富含ＧＣ四．限制酶的特点2021/10/3苏州科技学院生物系叶亚新３）对

6、称性—双对称EcoRI5’-GAATTC-3’3’-CTTAAG-5’４）切点大多数在识别顺序之内，也有例外５）限制酶切后产生两个末端，末端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ2.末端种类１）３’-端突起，个数为２或４个核苷酸PstI5’-CTGCAG-3’5’-CTGCAG-3’3’-GACGTC-5’3’-GACGTC-5’２）５’-端突起，个数为２或４个核苷酸EcoRI5’-GAATTC-3’5’-GOHPAATTC-3’3’-CTTAAG-5’3’-CTTAAPHOG-5’四．限制酶的特点2021/10/3苏州科技学院生物系叶亚新３）平齐末端S

7、maI5’-CCCGGG-3’5’-CCCGGG-3’3’-GGGCCC-5’3’-GGGCCC-5’４）非互补的粘性末端ａ）切点在识别顺序之外的，如：FokIFokI5’-GGATG(Ｎ)9-3’5’-GGATG(N)93’-CCTAC(Ｎ)13-5’3’-CCTAC(N)13ｂ）能识别简并顺序的，如：AvaIAvaI5’-CPyCGPuG-3’CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG四．限制酶的特点2021/10/3苏州科技学院生物系叶亚新1.定义：能识别相同序列但来源不同的两种或多种限制酶2.特点：1）识别相同顺序2）切割

8、位点的异同KpnIGGTACCAsp718GGTACCSstICCGCGGSacICCGCGG五.异源同序酶（isoschizomer，同裂酶）2021/10/3苏