《酶蛋白的结构》PPT课件

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1、第三章酶蛋白的结构蛋白质的一级结构（primarystructure）蛋白质的二级结构（secondarystructure）蛋白质的三级结构（tertiarystructure）蛋白质的四级结构（quaternarystructure）蛋白质结构和功能的关系举例：镰刀状细胞贫血病镰刀状细胞贫血病是最早被认识的一种分子病，流行于非洲的一些地区，患者的红细胞形态异常，有很多呈新月状或镰刀状，在红细胞脱氧时镰刀状细胞数量增加，严重时导致红细胞破裂、溶血而致命。镰刀状红细胞产生的原因是患者的血红蛋白异常。血红蛋白是红细胞内起携带氧气功能的一种重要的蛋白质，是一种四聚体蛋白质，由两个α亚基

2、和两个β亚基组成（α2β2），其中α亚基包含141个氨基酸残基，β亚基包含146个氨基酸残基。镰刀状细胞贫血病患者由于基因突变，其血红蛋白（HbS）的β亚基N-末端第6号位的氨基酸由原来正常血红蛋白（HbA）的高度极性的Glu变成了非极性的Val这种改变导致血红蛋白表面电荷减少，在脱氧状态下溶解度下降，发生不正常聚集，形成镰刀状红细胞，严重时造成红细胞破裂。血红蛋白分子共有574个氨基酸残基组成，仅仅两个β亚基上各改变了一个氨基酸残基，生理功能就发生了如此大的变化，可见蛋白质的一级结构对功能的影响之大。牛胰核糖核酸酶复性实验8个Cys－SH形成4个二硫键的组合方式有7×5×3=10

3、5种，因而重新形成正确配对的概率仅1/105，第一节蛋白质一级结构研究方法1.蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定2.确定蛋白质分子中多肽链的数目3.拆分并分离蛋白质分子的多肽链4.测定每条多肽链的氨基酸组成5.多肽链的N-末端和C-末端分析6.多肽链的局部断裂和肽段的分离7.测定各个肽段的氨基酸顺序8.确定肽段在多肽链中的次序从而排列出多肽链的氨基酸顺序9.多肽链中二硫键位置的确定1.蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定电泳单一带SDS-PAGE测分子量（质谱法）2.确定蛋白质分子中多肽链的数目末端分析法3.拆分并分离蛋白质分子的多肽链氧化法氧化法的优点在于二硫键一旦拆开，不会重

4、新形成连接，但在氧化过程中伴随着一些副反应，Met侧链被氧化生成亚砜，Trp侧链被破坏。还原法为了防止游离巯基重新氧化，还需加入烷化剂如碘乙酸，使巯基上发生取代反应而不会重新被氧化4.测定每条多肽链的氨基酸组成蛋白质完全水解：要求完全水解且不破坏氨基酸1）酸水解：作水解程度时间图确定最佳时间1-10mg蛋白样品→加HCl→抽真空→封闭→烘箱特点：a）Trp完全破坏，生成不溶性物质b）Ser、Thr、Tyr部分破坏，Ser破坏10-15%，Thr、Tyr破坏5-10%，应予以校正c）Asn→AspGlu→Glnd）胱氨酸→半胱氨酸e）大部分氨基酸不破坏2）碱水解：特点：a)Trp不破

5、坏b）大部分氨基酸破坏分离检测：1）纸层；2）薄层；3）离交；4）氨基酸自动分析仪5.多肽链的N-末端和C-末端分析目的：有几条肽链；N、C末端是何氨基酸测不出末端的几种原因：蛋白质分子为环肽；末端被保护试剂保护；末端是Pro5-1N端测定（介绍原理、分离检测方法和优缺点）1）FDNB法（Sanger法；2.4-二硝基氟苯法）a）原理：b)分离检测：乙醚萃取，DNP-Aa溶于乙醚而Aa不溶标准Aa+DNP——反应——纸层——喷茚三酮未知DNP-Aa——纸层——喷茚三酮比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成c）优点：反应条件温和，末端产物易分离缺点：N端是Pro测不出；

6、不能进行N端测序Lys的另一氨基生成e-DNP-Lys，由于它不溶于乙醚故不影响测定结果2)丹磺酰氯法（DNS法）a)原理：b）分离检测：DNS-Aa溶于乙酸乙酯，Aa不溶标准Aa+DNS——反应——纸层——荧光显色未知DNS-Aa——纸层——荧光显色比较即得结果，若结果是两点以上则证明是有几条肽链组成c）优点：灵敏度高；是前种方法的100倍；用量少，样品量为0.1-2ng缺点：DNS-Pro、DNS-Try被破坏；N端是Pro、Try测不出；不能进行N端测序3)Edman降解法[苯异硫氰酸酯法（PITC法)]a)原理：a）分离检测：PTH-Aa溶于乙酸乙酯、丁酸乙酯，Aa不溶c）

7、优点：N端是Pro可测；能进行N端测序缺点：灵敏度稍差4）DansyCl-Edman法既可检测N端序列又有较高灵敏度5)亮氨酸氨肽酶法此酶专一水解N端羧基形成的肽键，可测N端序列，但不能测N端为Pro.5-2C-末端分析C-末端分析方法也有很多，但至今还不能令人满意，常用的有肼解法、还原法、羧肽酶法等。1）肼解法原理：b）分离检测：苯甲醛+酰肼→沉淀→离心上清液中含游离基酸2)还原法用还原剂如硼氢化锂处理肽链，则C-末端残基的α-羧基被还原成醇，将肽链完全水解后，分析