《工具酶和基因载体》PPT课件

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1、第三节工具酶和基因载体2.3.1基因工程的工具酶●限制性核酸内切酶●DNA连接酶●DNA聚合酶●碱性磷酸酯酶●S1核酸酶●逆转录酶能在特定部位限制性地切割DNA分子。SmaICCCGGGGGGCCCCCCGGGGGGCCC在识别的序列中如果存在甲基化碱基，不能切割2.3.1.1限制性核酸内切酶①粘性末端粘性末端与平末端限制性内切酶进行酶切时，两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是交错的，产生的DNA片段末端的一条链多出一到多个核苷酸，这样的末端称为粘性末端。两条多聚核苷酸链上磷酸二酯键断开的位置如果是平齐的，这样的末端称为平末端。②平末端1限制性内切酶的分类IIIIII作用底物

2、双链DNA双链DNA双链DNA识别序列特异特异特异切割位点距识别部在识别部位内部距识别部位位1000bp25－27bp功能切割、修饰切割切割、修饰能量需要不需要需要举例EcoBEcoKEcoRIEcoPI2II型限制性内切酶的命名原则（1）限制性内切酶的基本名由3个字母组成。第一个是该酶所属微生物属名的第一个字母，大写、斜体。第二个和第三个字母是该酶所属微生物种名的第一和第二个字母，小写。例如：大肠杆菌EscherichiacoliEco流感嗜血菌haemophilusinfluenzaeHin（2）如同一种菌有不同的菌株或不同的品系，把菌株或品系的名称写在基本名的后面。如从大肠杆菌

3、R品系中分离到的酶，记做EcoR（3）同一种菌有几种不同的酶时，用罗马数字表示。如在大肠杆菌中R品系中分离到了5种酶，分别叫EcoRI、EcoRII……EcoRV（4）如同一属中不同种的种名前两个字母相同时，取种名较靠前的字母表示HaemophilusparainfluenzaeHarHaemophilusparahaemlyticusHph识别双链DNA分子中4-8对碱基的特定序列大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构5‘…GCTGAATTCGAG…3’3‘…CGACTTAAGCTC…5’EcoRI的识别序列EcoRI的切割位点3II型限制性内

4、切酶的识别位点和切割特性EcoRI等产生的5‘粘性末端5‘…G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C…5’EcoRI37℃5‘…G-C-T-G-OHP-A-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-A-POH-G-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-GA-A-T-T-C-G-A-G…3’3‘…C-G-A-C-T-T-A-AG-C-T-C…5’OHPOHPPstI等产生的3‘粘性末端5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-

5、C…5’PstI37℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-A-OHP-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-POH-A-C-G-T-C-C-T-C…5’退火4-7℃5‘…G-C-T-C-T-G-C-AG-G-A-G…3’3‘…C-G-A-GA-C-G-T-C-C-T-C…5’OHPOHP①连接便利粘性末端的意义i）不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。ii）同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。这比连接两个平齐末端容易的多。③补平成平齐末端凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。②5’末端

6、标记凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。PvuII等产生的平头末端5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C…5’PvuII37℃5‘…G-C-T-C-A-G-OHP-C-T-G-G-A-G…3’3‘…C-G-A-G-T-C-POH-G-A-C-C-T-C…5’识别位点的序列相同的限制性内切酶。同裂酶（Isoschizomers)HindⅢ5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’HsuI5’-AAGCTT-3’3’-TTCGAA-5’识别的序列

7、不同，但能切出相同的粘性末端。如BamHI、BglⅡ、BclI、XhoⅡ等同尾酶(Isocaudamers）5’-GGATCC-3’3’-CCTAGG-5’BamHIBclI5’-TGATCA-3’3’-ACTAGT-5’5’-AGATCT-3’3’-TCTAGA-5’BglⅡ5’-UGATCY-3’3’-YCTAGU-5’XhoⅡU代表嘌呤；Y代表嘧啶。5’-GATC----3’3’----CTAG-5’Sau3A同尾酶的粘性末端互相