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时间:2019-06-18
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1、第三章基因的克隆方法前言基因是生物染色体上的一段DNA序列,具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能。2基因的表达过程mRNA翻译成蛋白质基因组DNA3如何获得基因?——即基因的克隆方法基于基因产物的基因克隆方法基于基因加标签的基因克隆方法基于基因序列的基因克隆方法基于基因图谱的基因克隆方法4一、基于基因产物的基因克隆方法mRNA翻译成蛋白质1、根据蛋白质序列克隆目的基因2、根据基因表达差异(mRNA)克隆基因5原理:根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列,反推核苷酸序列,然后设计探针或引物从基因组文库或cDNA文库中分离出相应的基因。1、蛋白
2、质序列克隆法6实用性:分离纯化蛋白质十分困难CysMetAspGluMetLysArgAsnIleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATACTGATGGGTTC据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列注意!密码子有简并性现象!72、根据基因表达差异(mRNA)克隆基因基因表达的差异表现:一是基因表达的种类的不同;二是基因表达水平的改变。8差减杂交(SH)抑制性差减杂交(SSH)差异显示PCR(DDRT-PCR)DNA代表性差异分析(DNARDA)扩增限制性片段长度多样性(AFLP)cDNA微阵列已发展的相应基因克隆方法:9差减杂
3、交(SH)最早由Lamar和Palmer于1984年提出并用于雄鼠Y染色体的DNA研究。超声波打断雌鼠的DNA(过量100倍)(XX)MboI完全消化雄鼠的DNA(XY)变性、复性去除共有序列BamHI酶切表达载体连接、转化、测序分析缺点:技术要求高,耗时,工作量大NO.1NO.2NO.310SH在mRNA研究上的应用机理:!!不足之处:重复性差,灵敏度低,回收的cDNA量有限。特异表达基因的样本(TS)无特异表达基因的样本(RS)提取mRNA提取mRNAcDNAcDNA转录转录过量杂交TS的CDNA纯化、富集、扩增去除过量的RS的cDNA及杂交分子11
4、基因突变体的研究:如基因的表达与不表达;基因时空表达的研究:如根、茎、叶;不同处理条件下的基因表达差异:如施肥与不施肥、光照与不光照。差减杂交技术的应用方面:121.2.2抑制性差减杂交(SSH)Tester样本mRNADriver样本mRNASfiIAcDNAcDNASfiIBAB混合,变性杂交过量ABPCR扩增5`3`13应用基因突变体的研究:如基因的表达与不表达基因时空表达的研究:如根、茎、叶不同处理条件下的基因表达差异:如施肥与不施肥、光照与不光照141.2.3差异显示PCR(DDRT-PCR)最先由Liang等于1992年报道,目前已广泛在实
5、验室使用。主要原理:利用真核生物mRNA结尾处有POLY(A)结构,在其3`端设计象5`-T11GA样引物,该引物可与mRNA总数的十二分之一结合,从而使这部分基因得到逆转录,同时结合5`端的随机引物(20条10-mer),可以使不同长度的基因得到扩增。5`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNA155`3`AAAAAAAAATGCAGCTTTTTTTTTTRPmRNAAATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCG
6、TTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT1617具体操作:1、提取mRNA;2、特定引物(12分之一)反转录;3、特定引物和RP结合RT-PCR;4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较DNA带,从而找出差别DNA。18缺点:假阳性条带多,对低丰度的基因表达不容易检测。工作量大。无法定量研究。扩出的条带往往是3`端比较短的UTR区的一段序列,提供的信息较少。19优点:简便、灵敏、高效、省时,能快速显示mRNA的组成。所需的mRNA量少。各样本mRNA的差异可同时进行比较。扩出的cDNA可直接用于测序、文库筛
7、选等。20二、基于基因加标签的基因克隆方法原理:主要是在生物基因组中插入外源的一段DNA,使生物体产生某种突变表型,然后反过来利用这段外源已知的DNA片段来克隆基因的方法。21外源DNA基因组染色体DNA基因A产生突变型分类:T-DNA标签法转座子标签法。22T-DNA标签法克隆基因技术路线:农杆菌侵染植物得到转化苗,筛选出表现某种突变性状的个体。建立突变体基因组文库及野生型基因组文库.用T-DNA片段做probe筛选突变体文库,获得阳性克隆。用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库,获得野生型的阳性克隆。把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。2
8、3野生株转基因株目的基因染色体T-DNA染色体T-DNA探针筛选转
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