一株兔源耐药性肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定

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1、万方数据中国畜牧兽医2013年第40卷第9期疾病防治·199·一株兔源耐药性肺炎克雷伯氏菌的分离与鉴定张智，李再新，曾光菊。李丙超，胡卫东，赵志平．刘章琴。陈欲云(四川理工学院化学与制药工程学院，四川自贡643000)摘要：本试验旨在对从患呼吸道感染和腹泻的仔兔血液中分离的1株疑似病原菌进行鉴定。采用分离培养、镜检、生化检测、荚膜染色、16SrDNA序列测序、药敏试验和动物体内感染等方法，对该疑似菌进行了分析。结果显示，该疑似菌呈杆状、含有丰富的荚膜多糖，其16SrDNA序列与肺炎克雷伯氏菌标准菌株序列相似性达到99％，且对链霉素、庆大霉素、氨苄青霉素、硫酸庆大霉素、

2、硫酸卡那霉素和氯霉素均表现出不同程度的显著抗性。腹腔注射该菌(109CFU／mL)，仔兔全部死亡；而I：1腔灌喂，仔兔有较强的耐受性(无死亡)。结果表明，从患病仔兔血液中分离到1株肺炎克雷伯氏菌且具有致病性。关键词：肺炎克雷伯氏菌；耐药性；分离；鉴定中图分类号：$852．61文献标识码：A文章编号：1671—7236(2013)09—0199—05肺炎克雷伯氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)属肠杆菌科、克雷伯氏菌属，是肠道有荚膜的革兰氏阴性杆菌及人和动物共患的条件性致病菌，主要分布于机体的消化道、呼吸道、泌尿生殖系统及皮肤等(Podsehun等，199

3、8；Lai等，2000；Brisse等，2005)。当机体免疫力下降或长期服用抗生素菌群生长失调时引起感染，导致人和动物的肺炎、肠炎、脑膜炎、前列腺脓肿和肝脏脓肿，甚至败血症等，对多种抗生素产生耐药性，若治疗不当死亡率极高(Lu等，2002；Wong等，2004；Kohler等，2007；马磊等，2011)。长期以来，普遍认为它只是一种条件致病菌，对人和动物危害不大，报道不多，尚未引起重视(王亨等，2008)。但随着抗生素滥用加剧，肺炎克雷伯氏菌逐渐演变成无药可治的超级细菌，危害家禽和家畜，同时也危害住院治疗的新生病儿(吴兴海等，2011；Didelot等，2007)

4、。自贡某仔兔养殖场，20％仔兔易发生腹泻并打喷嚏，患病后80％以上死亡，作者从患病死亡的仔兔血液中发现1株疑似病原的优势菌株，本试验拟通过传统生理生化和分子生物学方法对该菌株进行技术鉴定。1材料与方法1．1材料收稿日期：2013—02—04作者简介：张智(1977一)，男，四川人，博士。副教授，研究方向：微生物免疫学及疫苗研究。通信作者：李再新。E—mail：lizaixin@sina．tom．cn；Tel：0813—5505605基金项目：四JII省教育厅重点项目(12ZA088)；四川理工学院人才工程项目(201IRCl6)。1．1．1病料四jiI自贡地区某兔场，

5、多只仔兔表现为打喷嚏、腹泻、不采食及精神萎靡等症状，常规青霉素类抗生素治疗无效后死亡。收集该死亡仔兔备用。1．1．2主要试剂与仪器尸几酶、pMDl8一T和DNAMarker均购自宝生物工程(大连)有限公司；链霉素、氨苄青霉素、环丙沙星、庆大霉素、硫酸庆大霉素、氯霉素和头孢曲松钠等抗生素及麦康凯琼脂、伊红美蓝培养基和琼脂粉等均购自上海生工生物工程技术服务有限公司；其他试剂均为国产分析纯。智能型电热恒温培养箱(DHP一9160B，上海琅歼实验设备有限公司)、UV759s紫外分光光度计、Eppendorf高速离心机、UV自动凝胶成像系统、TechPCR仪、VEGA3Easy

6、Probe型扫描电子显微镜。1．2方法1．2．1病料采集、病原的分离与纯化在无菌条件下解剖死亡仔兔，分别收集心脏血液、肝脏、脾脏、肺脏和粪便等病料，直接进行涂片、染色和镜检。用PBS倍比稀释心脏血液病料，并均匀涂布在LB培养基平板上，37℃倒置培养16h，观察菌落生长状态。挑取具有生长优势的菌落，依次接种于伊红美蓝培养基及麦康凯培养基上，37℃倒置培养18～24h后观察菌落的颜色、形态。将该菌落接种于LB液体培养基中，37℃培养18～24h，倍比稀释进行涂片、染色和镜检，确认为纯培养物后，加入甘油(V培养基：V甘油=4：1)，于一80℃保存备用。1．2．2生化试验检测

7、按照《常用细菌系统鉴定、手册》，将分离培养的菌株分别接种于微量生化管万方数据·200·疾病防治中国畜牧兽医2013年第40卷第9期中，37℃培养24～48h进行发酵，培养基分别含葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、枸橼酸盐、尿素等；并设计MR、V—P和三糖铁琼脂反应。1．2．3扫描电镜观察经形态学和生化试验确定为纯培养物后，将菌体接人含10mLLB液体培养基的摇瓶，振荡培养12h，吸取800“L菌液3000r／min离心3min，弃上清，加入500肛LPBS洗2～3次；在沉淀中加入4％戊二醛1mL，充分混匀，4℃静置4h；3000r