血清成分的生化分析

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1、综合实验二：血清成分的生化分析实验五血清胆固醇的定量测定（4学时）实验六血清蛋白的分离纯化（12学时）实验七血清中转氨酶活力的测定（8学时）实验六血清清蛋白与γ-球蛋白的分离及鉴定生命与环境科学学院生化组总体步骤：盐析→透析→浓缩→电泳（期间穿插凝胶柱层析）一、盐析50%饱和度，血清球蛋白沉淀α、β、γ-（33%饱和度沉淀）100%饱和度，血清清蛋白沉淀（NH4）2SO4：破坏水膜、中和电荷纯度鉴定：层析（柱）、电泳等二、透析目的：去盐（柱层析也可）透析袋：装样量：1/2～2/3三、浓缩目的：去水（蔗糖）四、电泳目的：鉴定清蛋

2、白和γ-球蛋白纯度五、层析练习：分离蓝葡聚糖和重铬酸钾（蓝色+黄色）实验材料鸡血清：三黄鸡血清或乌骨鸡血清实验六——（一）血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析、透析与浓缩一、目的1、掌握盐析法分离蛋白质的原理和方法2、掌握透析法脱盐及蛋白质浓缩的方法二、试剂及仪器用品血清PBS（NH4）2SO4溶液蔗糖双缩脲试剂酪蛋白BaCl2溶液离心机烧杯移液管透析袋三、原理中性盐类能破坏溶液中蛋白分子表面的双电层和水膜，从而使蛋白质从溶液中凝聚沉淀析出。沉淀不同蛋白质所需盐类浓度不同。如，50％饱和的硫酸铵能使血清中的球蛋白沉淀，而33％饱和的硫

3、酸铵则使γ-球蛋白沉淀。因此，可根据所要分离的蛋白质，选择不同饱和度的硫酸铵溶液进行盐析。透析是利用蛋白质等生物大分子不能通过半透膜的性质的一类纯化方法，可利用该方法分离大分子与小分子的混合物。由于NH4+和SO42-可以通过半透膜，而血清清蛋白不能，因此，可以利用透析的方法使清蛋白溶液脱盐。透析装置利用半透膜还可以进行大分子溶液的浓缩。将盛有待浓缩的大分子溶液的透析袋放入高浓度的吸水性强的蔗糖固体颗粒中，袋内溶液中的水被袋外的多聚物所吸收而有效地浓缩。四、实验步骤1、盐析、透析与浓缩离心管2mL血清2mLPBS2mL（NH4

4、）2SO4摇匀静置30′3000rps离心20′上清液（主要含清蛋白）沉淀（主要含γ-球蛋白）3.132g（NH4）2SO4上清液静置30′，离心20′1mL水（或PBS）沉淀流水透析1h蔗糖浓缩清蛋白1mLPBS沉淀1mL水（或PBS）流水透析1h蔗糖浓缩γ-球蛋白滴加0.5mL（NH4）2SO4静置30′，离心20′沉淀（γ-球蛋白）实验六——（二）血清清蛋白与γ-球蛋白的鉴定——醋酸纤维薄膜电泳一、目的学习醋酸纤维薄膜电泳的操作了解电泳技术的一般原理。二、原理醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。醋酸纤维

5、薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120μm微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便，快速，样品用量少，应用范围广，分离清晰，没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白，脂蛋白，血红蛋白，糖蛋白和同工酶的分离及用在免疫电泳中。蛋白质是两性电解质，在pH不等于其等电点的溶液中，可带有电荷，在电场中会向着与其所带电荷相反的电极移动。血清中含有白蛋白、α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等蛋白质，各种蛋白质由于氨基酸组分、立体构象、相对分子质量、形状及等电点不同，在电场中迁移速度

6、就不同，故通过电泳法可将其分离。三、实验器材1、醋酸纤维薄膜（2×8cm）2、常压电泳仪、电泳槽3、点样器（市售或自制）4、培养皿（染色及漂洗用）5、粗滤纸、直尺、单面刀片、电吹风6、玻璃板7、竹镊子8、白磁反应板等四、实验试剂1、巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.07）：1000mL：巴比妥2.76g，巴比妥钠15.45g，加水至1000mL。2、染色液：300mL含氨基黑10B0.25g，甲醇50mL，冰醋酸10mL，水40mL〈可重复使用〉。3、漂洗液：2000mL含甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50

7、mL。4、透明液：300mL：含无水乙醇7份，冰醋酸3份。5、血清：新鲜，无溶血现象五、操作总体步骤：膜处理——30′装置——电泳槽电极缓冲液：两槽等高搭桥点样→电泳→染色→漂洗→透明需做三条膜：全血清、γ-球蛋白、清蛋白1、膜处理——膜的浸泡用无齿镊子取醋酸纤维薄膜一张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上做好记号）放在缓冲液中浸泡20min。2、电泳槽的准备根据薄膜宽度剪裁合适的滤纸条。在两个电极槽中各倒入等体积电极缓冲液，在电泳槽两个膜支架上各放两层滤纸条，滤纸的一端与支架前沿对齐，另一端浸入电极缓冲液内。当滤纸条全部润湿后

8、，用玻棒轻轻挤压在膜支架上的滤纸以驱逐气泡，使该端滤纸紧贴于膜支架上。滤纸条是两个电极槽联系醋酸纤维素薄膜的桥梁，故称为滤纸桥。3、点样把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸中吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上）。将点样器先于放置在白磁反应板上的血清中沾一下，再在