不同中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞_酪蛋白表达的影响

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1、第40卷第1期东北农业大学学报40(1):66~712009年1月JournalofNortheastAgriculturalUniversityJan.2009文章编号1005－9369（2009）01－0066－06不同中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响*葛增广，佟慧丽，秦君，李庆章，高学军（乳品科学教育部重点实验室，东北农业大学食品学院，哈尔滨150030）摘要：为探讨中药对小鼠乳腺上皮细胞泌乳功能的影响，选取5种与泌乳相关的中药（王不留行、甲珠、通草、蒲公英、漏芦）研究其对体外培养的小鼠

2、乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响。采用荧光定量RT-PCR及毛细管电泳技术分别对β-酪蛋白的mRNA和蛋白表达水平进行检测，并应用激光共聚焦显微镜技术检测泌乳信号转录因子Stat5的含量变化。结果表明，通草、蒲公英和漏芦能显著促进β-酪蛋白的表达，王不留行和甲珠能极显著促进小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白的表达。提示王不留行、甲珠和通草可通过影响乳腺上皮细胞乳蛋白基因的表达而促进泌乳，其机理尚待进一步研究。关键词：中药；小鼠；乳腺上皮细胞；Stat5；β-酪蛋白中图分类号：S865.1+3文献标识码：A酪蛋白是乳腺

3、上皮细胞产生的磷酸化蛋白，1.2试剂它的合成及分泌是研究激素、细胞外基质对乳腺优质胎牛血清，杭州四季青；DMEM培养基，细胞分泌作用的标志。酪蛋白作为乳蛋白主要的Gibco；催乳素，Sigma；胶原酶I，Gibco；细胞角组分，反映了泌乳能力的质量与水平，成为泌乳蛋白18抗体，Acris；Stat5抗体，上海碧云天；研究的热点。目前乳腺上皮细胞泌乳功能主要集荧光定量PCR试剂盒，北京Tiangen；EDTA、硼[1-2]中于乳蛋白基因表达及合成和分泌能力的研究。砂、硼酸等常规试剂，国产。β-酪蛋白基因的特异性

4、调控元件是目前乳腺生物1.3仪器[3-5]反应器的研究基础。中草药具有多成分、多环CO-150型CO2培养箱，日本；DFC280倒置节、多途径、多靶点等特点，对于中药催乳的药相差显微镜，德国LEICA；毛细管电泳系统，美理机制研究者甚少。本研究选用几种常见的调乳国MARAREG；DU640紫外分光光度仪，美国中药甲珠、蒲公英、通草、王不留行和漏芦提取BECKMAN；G8000凝胶成像系统，美国UVP；物，研究其对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白分泌及Prism7300实时荧光定量PCR仪，美国ABI；TC泌乳能力的

5、影响，并探讨其机理，为筛选有效催SP2AOBS激光扫描共聚焦显微镜，德国LEICA。乳中药应用于奶牛产奶等畜牧生产提供工作基1.4方法础。1.4.1小鼠乳腺上皮细胞的原代培养及鉴定小鼠乳腺上皮细胞的原代培养见文献[6]，乳1材料与方法腺上皮细胞角蛋白18的鉴定见文献[7]。1.1材料1.4.2小鼠乳腺上皮细胞的中药处理甲珠、通草、王不留行、漏芦、蒲公英购自分别取适量的王不留行、甲珠、通草、蒲公哈尔滨人民同泰药店；3月龄昆明种远交系小白英、漏芦以水煎制，浓缩后分别加入小鼠乳腺鼠，购自哈尔滨医科大学实验动物中心。

6、上皮细胞的培养体系中，此外，设置空白组和收稿日期：2008-07-07催乳素处理组。处理48h后分别对小鼠乳腺上基金项目：东北农业大学创新团队发展计划资助（LXT005-1-2）皮细胞β-酪蛋白基因的mRNA及蛋白表达量进作者简介：葛增广（1980-），男，黑龙江人，硕士研究生，研究行检测，进行Stat5激光共聚焦显微镜免疫荧光方向为乳腺发育与泌乳功能调控。*通讯作者E-mail:gaoxj5390@sina.com染色试验。第1期葛增广等：不同中药提取物对小鼠乳腺上皮细胞β-酪蛋白表达的影响·67·1.4.

7、3荧光定量RT-PCR得出Ct值，目的基因与内参照基因之差即为△Ct，-△Ct试验方法见文献[6]。2即为目的基因的相对表达量，结果见表1。1.4.4毛细管电泳方法测定β-酪蛋白含量细胞经破碎和过滤制成毛细管电泳样品，用酸、碱、去离子水和缓冲液对毛细管进行处理；进样时间10s。电泳条件：运行缓冲液为pH-19.0，20mmol·L的硼砂-硼酸缓冲液，电泳温度25℃，电压20kV，电泳时间5min，检测波长200nm。其中每个样品设3个平行。1.4.5Stat5因子的表达定位试验方法见文献[6]。图1小鼠乳腺上

8、皮细胞的原代培养（×200）1.4.6不同中药提高小鼠泌乳量的动物试验Fig.1Cultureofmousemammaryglandepithelial以注射用水将5种中药提取物配制成浓度为cells(×200)-11mg·mL，过滤除菌制备成中药注射液备用。取分娩后母鼠，自分娩当天起将每窝仔鼠调整为5只。于泌乳7d后每日同一时间将母鼠与仔鼠分离6h，用天平称全窝仔鼠重量，然后将仔鼠送回母鼠身边哺乳