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《不同来源白首乌rDNAITS序列分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、第35卷第12期Vol35,Issue122010年6月June,2010不同来源白首乌rDNAITS序列分析1121*张宁,闫滨,徐星航,徐凌川(1.山东中医药大学药学院,山东济南250355;2.山东省济钢高级中学,山东济南250100)[摘要]目的:研究白首乌不同种的ITS序列遗传差异性,分析序列差异性在白首乌品种鉴定及种质资源研究中的意义。方法:从不同来源的白首乌中提取总DNA,以核基因组ITS通用引物进行扩增,扩增产物经克隆后,进行测序。结果:获得4个不同来源样品的ITS全序列
2、及58S全序列以及两端的18S,26S的部分序列,其中戟叶牛皮消CynanchumbungeiITS序列为国际首次获得,登录号分别分别为GU198970(野生种),GU479037(栽培种)。各样品间ITS序列存在不同,4个样品序列间共存在10个变异位点。结论:ITS序列对白首乌种质资源鉴定具有较好的分辨性,为鉴别不同来源的白首乌提供了依据。[关键词]白首乌;克隆;ITS序列;序列分析白首乌主要来源为戟叶牛皮消Cynanchum叶,直接用于DNA提取,4种植物均经山东中医药bungeiDecne.、耳叶牛皮消C.auric
3、ulatumRoyleex大学药学院生药系徐凌川教授鉴定,材料来源[1]Wight、隔山消C.wilfordiiHems.l的块根,均具有见表1。补肝肾,强筋骨,益精血,乌须发等功效。1977年版表1不同来源的白首乌样品的中国药典以白首乌药名收录的仅为萝藦科植标号拉丁名采集地点物戟叶牛皮消,由于该种资源较少,之后的各版药典1隔山消Cynanchum.wilfordii昆嵛山均未收载。因此,白首乌作为传统的著名抗衰老中2耳叶牛皮消C.auriculatum本校药圃3泰山白首乌C.bungei济南梯子山药的概念趋于弱化,近年来,泰
4、山白首乌(戟叶牛皮4泰山白首乌C.bungei泰山白首乌种植基地[23]消)开始进行人工栽培,为该中药的复兴、原植物资源保护和开发利用奠定了基础。为确保泰山白[7]12DNA提取取新鲜叶片,参照Rodrigues组首乌的种质、种源,有必要对其进行分子生物学方面织培养表面消毒的方法处理后各01g,加液氮研磨的研究,以配合GAP种植方面的性状观察和良种成细粉后,使用改良的CTAB法提取总DNA,于选育。-20!保存备用。在用于解决属下不同种和种内系统发育和分类13PCR扩增以提取的DNA为模板,采用PCR问题时,目前常
5、采用核糖体DNA中的内转录间隔区扩增通用引物ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG;(internaltranscribedspace,ITS)序列的测定,以分析[45]ITS4:TCCTCCGCTTATTGATATGC(均由上海生工生物种的同源性和不同居群的遗传水平。郑传进[6]物工程技术有限公司合成)进行扩增。PCR扩增体等报道了耳叶牛皮消的ITS序列,但白首乌其他系总体积为50L,包括:模板DNA(适宜浓度)5种的DNA序列未见报道。本实验从隔山消,耳叶牛-1L,引物ITS1与ITS4(10mol∀L)各1
6、L,皮消,泰山白首乌(野生种)和泰山白首乌(人工栽-1dNTP(10mmol∀L)1L,10#PCRbuffer(含培种)4种植物叶片中提取了DNA并测定其ITS序-1MgCl2)5L,Taq聚合酶(5U∀L)025L,加列,旨在为白首乌的分子鉴定提供依据。灭菌三蒸水至50L。PCR扩增条件为:98!预变1材料和方法性5min,然后进入如下循环:95!变性35s,55!11材料于2009年8月采集4种植物的新鲜嫩退火35s,72!延伸40s,35个循环,72!延伸8[稿件编号]20100121007min。
7、扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳进行分析。[通信作者]*徐凌川,教授,Emai:lxulingchuan518@sina.com14PCR扩增产物的纯化、克隆、测序将扩增的[作者简介]张宁,硕士研究生,Emai:lzhangning301@163.com目的ITS序列进行琼脂糖凝胶电泳,通过UNIQ10∀1537∀第35卷第12期Vol35,Issue122010年6月June,2010柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工生物工程技术度为234bp,58S序列的长度为162bp,
8、ITS2序列有限公司)对凝胶目的条带进行纯化回收;通过A的长度为245bp。3种不同来源的白首乌(4个样tailingKit(SK2291)试剂盒在3∃端加A;然后按照T品)中共有10个碱基存在变异,其中5个为碱基颠载体PCR产物扩增试剂盒(S
