小鼠胚胎干细胞的体外标记、诱导分化及颅内移植研究

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1、天津医科大学博士学位论文小鼠胚胎干细胞的体外标记、诱导分化及颅内移植研究姓名：卓杰申请学位级别：博士专业：神经外科指导教师：杨树源2003.5.1摘要小鼠胚胎干细胞(embryonicstemcell，ES)源自发育3．5天囊胚的内细胞团，它具有全能性的分化能力和无限的自我更新能力。在体外培养条件下，ES细胞可以分化成包括生殖细胞在内的所有细胞类型，是细胞替代性治疗中理想的供体细胞。Es细胞能够在体外长期培养和增殖，是进行基因修饰的良好平台。在本实验中，我们采用EGFP基因作为标记基因，通过随机整合的方式获得了EGFP基因普遍表达，能够发出绿色荧光，并保持ES细胞特性的细胞系；绿色荧光在转化细

2、胞进行体外培养、传代和分化时仍能够稳定表达。将该Es细胞系悬浮培养时，可以聚集成类胚体(embryonicbody，EB)。在类胚的培养体系中加入视黄酸(retinoicacid，RA)诱导(4一／4+法)后，EB可以再次贴壁生长，大部分细胞伸展、分化成神经细胞(神经元、神经胶质细胞)，而且分化后的细胞仍然可以发出绿色荧光，所以这种经EGFP转导的细胞系是研究ES细胞体内外分化、移植和干细胞治疗的一个良好工具。我们利用自由落体法构建了大鼠的机械性颅脑损伤模型，在伤后的24h内，将EGFP标记的小鼠ES细胞植入到了脑损伤区。连续观察发现：移植的Es细胞主要集中在脑损伤区，损伤区局部有大量的胶质细

3、胞和纤维增生，这些增生的胶质细胞和胶质纤维对ES细胞有阻断作用，故电镜下只见到ES细胞间对接，而宿主神经元和移植的ES细胞间没有发现细胞连接。在所有接受ES细胞移植的大鼠(n=44)中，有4例在移植部位的头皮下长出实体性肿物，冰冻切片上，源自这些肿物的细胞均能发出强烈的绿色荧光；经病理学诊断证实，一例与人类的毛细胞性星型细胞瘤相符；另一例则符合PNETs(原始神经上皮性肿瘤一髓母细胞瘤)的表现；另81"2例的病理表现符合结节性肉芽肿(典型的免疫排斥反应表现)，不仅如此在所有的移植部位都可以见到有明显的免疫排斥反应发生。关键词：胚胎干细胞系，EGFP基因，细胞分化，脑外伤，移植ABSTRACTM

4、ouseembryonicstem(ES)celllines，denvedfromtheinnercellmassof3．5dayblastocysts，aretotipotentandhavetheabilitytounlimiUyself-renew．EScellcanbeinducedtodifierentiatedintoalItissues．includinggermlinecells／nvitro．Theyarethebestcandidatedonorforcellreplacementtherapy．EScelllinecanbemaintainedandproliferate

5、dpermanently『门vitro,sotheyarefavorableforgenetransduction．Inthisstudy，weusedEGFPgeneasreportgene．andlabeledEScellwithitrandomly．EGFPexpressing(greenfluorescence)EScellswithnomalproperties，such髂viabilityanddifferentiationability，weresuccessfullygenerated．ThegreenflurescenceofEGFPexpressingcellsmainta

6、inedinpropagatingtheEScellsforlongterrnandindifferetiatedcells．Culturedinsuspension．the”green。。ESceilswereaggregatedandformedembryoidbodies．Afteraddingretinoicacid(RA)intheEBculturesystem(4-，4+)，theycouldre·adheretothebottomoftheplasticfoster，mostoflhemspreadedanddifferetiatedintoneuralceilsfsuchasn

7、euron，astrocytes)，andthepost—differetiatedcellsemittedgreenfluorescenceaswell．SO廿1eEGFPexpressingEScellsholdgreatflexibilityforthestudyofcelldifferetiation，transplantationandstemcelltherapy．1nthisstud