人巨细胞病毒体外感染巨核系细胞诱导凋亡的研究

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1、中山大学硕士学位论文人巨细胞病毒体外感染巨核系细胞诱导凋亡的研究姓名：孔宪玲申请学位级别：硕士专业：儿科学指导教师：王清文2003.5.8中山大学硕士学住论文中文摘要人巨细胞病毒体外感染巨核系细胞诱导凋亡的研究专业儿科学研究生孔宪玲导师王清文副主任医师摘要1人巨细胞病毒(HCMV)为疱疹病毒科成员之一，是双链DNA病毒，具有高＼度种属特异性。已被证实是一种广泛传播的病毒，各年龄段，各阶层的人群均可被感染。由于其具有潜伏．激活的生物学特征，在机体免疫功能正常时，通常表现为无症状或亚临床症状的带病毒者，而当机体免疫功能低下或缺陷时，内源性的HCMV再激活或

2、新的HCMV感染可成为活动性感染。例如AIDS和骨髓移植的病人，HCMV感染是主要的致病和致死原因。因此，HCMV感染正受到各学科各专业的普遍关注。许多实验已证实HCMV可抑制造血各系祖细胞的生长增殖，但对于HCMV与巨核系细胞相互作用的研究甚少。随着强效免疫抑制剂的研制成功，骨髓移植的开展，AIDS病人增多，HCMV感染已成为骨髓移植失败的主要原因之一，急待研究者们的解决。HCMV感染引起的血液系统并发症中以血小板减少症最常见，而许多实验证实部分HCMV感染可引起宿主细胞的凋亡，那么凋亡是否为HCMV感染、一引起血小板减少症的致病机制之一?体实验是基

3、于本课题组系列研究结果，迸一步采用HCMV体外感染巨核系细胞CHRF细胞，研究HCMV是否可引起巨核系细胞的凋亡，初步探讨其作用机制。rf材料与方法＼、1．材料CHRF细胞株由香港中文大学儿科系实验室提供。HCMVADl69株购于中国预防医学科学院病毒研究所，效价为10一TCID50／m1。2．方法CHRF细胞用含10％FCS的IMDM培养基培养，接种于不同的培养瓶或中山犬学硕士学位论文中文摘要皿，细胞铺满瓶底后加入不同浓度的HCMV进行持续感染。根据培养液中病毒浓度不同分为四组：(1)空白对照组(2)10d组(3)10‘2组(4)10。组然后于感染后

4、不同时间收集各组细胞，分别进行HCMVDNA扩增和凋亡检测。(1)PCR扩增在感染后不同时间收集各组细胞，抽提DNA，做PCR扩增HCMVIEA，电泳后观察是否有特异性阳性条带。(2)Giemsa染色在感染后不同时间对各组培养皿中细胞染色，即刻在光学显微镜下观察细胞形态。出现核固缩、核碎裂、细胞膜卷曲的细胞即为凋亡细胞。(3)DNAladder在感染后不同时间收集培养瓶中各组细胞，常规抽提DNA，在2％的琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下观察是否有特征性凋亡条带。(4)Annexin／PI在感染后不同时间收集培养瓶中各组细胞，每组至少106个细胞，清洗后用An

5、nexin／PI标记，即刻用流式细胞仪分析，有绿色荧光而无红色荧光的细胞群是凋亡细胞。(5)PI单染在感染后不同时间收集培养瓶中各组细胞，每组至少106个细胞，PBS清洗1-2次，用PBS和70％乙醇重悬细胞，过夜，PI染色，检测低于G1期DNA含量的细胞群体即为凋亡细胞。结果1．PCR扩增后，在2％的琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下各实验组可观察到HCMVIEA特异性扩增条带。空白对照组无。2．在HCMVADl69感染CHRF细胞后第5天，通过Giemsa染色在各感染组可观察到较多凋亡细胞，而空白对照组仅有极少数凋亡细胞。在第7天，可观察到同样结果。3．在

6、HCMVADl69感染CHRF细胞后，经Annexiil／PI双染后，观察凋亡细胞，记录凋亡率(％)。第3天，10习组为10．6士1．48，10。组为15．3+2．47，10。1组为21．8士1．24；第5天，10d组为18．7+1．79，10。2组为23．4士1．69，10。1组为27．9：t2．83{第7天，10。3组为21．3土2．49，10。2组为27．8士3．65，10’1组为34．4士3．91；第3、5、7天空白对照组分别为1．9士0．39，2．40士0．56和3．68+1．47。从结果可观察到随着病Ⅱ中山大学硕士学位论文中文摘要毒浓度的加

7、大和感染后时间的延长凋亡率呈上升趋势。4．在HCMVADl69感染CHRF细胞后第5天，收集细胞抽提DNA，经电泳可观察到各实验组的凋亡特征性条带，且随着病毒浓度的加大，条带逐渐清晰。5．在HCMVADl69感染CHRF株后，PI染色观察凋亡细胞，记录凋亡率(％)。第3天，lo-3组为8．8士1．10，10．2组为12．4士2．43，10。1组为17．4士1．84；第5天，10d组为22．4士1．54，ao-2组为25．84-1．63，10。1组为30．2+2．31；第7天，10。3组为24．5士1．74，100组为29．1“．32，10。1组为35．

8、6士1．68；第3、5、7天空白对照组分别为2．1士o．32，3．68士1．40和4．13士1