脂质体包埋反义Toll样受体4质粒对内毒素刺激小鼠的影响

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1、臌质体包煺反义Toll样受体4质控埘内毒索刺激小鼠瓣墨塑脂质体瞧埋殷义TolI样受体4质粒对内毒素刺激小鼠的影响背罱和目的：枣交接簧内毒索血瘢是由革兰氏阴性菌释放或裂解出的细胞脂多糖(1ipopo

2、ysaccharide，LPS)成份一一内海素所致。在肝虢疾病、重症胰腺炎、烧伤、感染等情况下常豢伴发内毒素血瘰。严蓬危及人镪躲健康恳无有效的治疗手段。近年来，随着Toll家族的发现，尤其是T01l样受体4(TLR4)的发现，内毒豢致病熬分子瓤铡纛在被逐爹鬻朔。TLR4在与肉毒素络台瑶，形成复合体进行信号转导，激活NF．xB等转黎因子，诱导细胞熙予如肿癌繇惩霞

3、予．g(彳NF-a)、自细胞介豢．1等过量裘达。增强了宿主对内毒索的免疫反成，但也给桃体带求了严霾的负性效应，导致宿主发热、出盘、低血压、休克、弥漫性血管内凝血(DIC)、多脏器功能衰竭(MOF)，甚至死亡。本疆懿在分子生耪举静笈震芨添寐静逵切需要豹簇穑上，剥粥反义技术构建反义TLR4表达质粒，转染入小鼠体内来对内毒素刺激小鼠进行派疗。躐溺其楚否辩低奎簸TLR4mRNA的水平以及减少内毒豢的毒性作用，以此探讨TLR4焱内毒豢血症中的僚号转黟作赐及其浚疗弱徐僵。糖辩秘方法：一、建立夏义TLR4表这覆粒裰摇小鬣TLR4cDNA(GenBank序弩AF0953

4、53)设计TLR4特异瞧Bl物，上游5’端带上EcoRl酶切经点，下游5’端袋上鼬nl傻点。以小鼠细胞RAW264．7抽提的总RNA为RT-PCR模板，扩增TLR4片段。用T4DNA连接酶爨TLR4产物连接裂pGEM-T载薅上，形癌pGEM-TLR4质粒，然后转染JMl09感受态细胞。在含氨苄肖霉素的LB琼脂平板上筛选鼯瞧壳爨，辍黩尧隆矮粒逡簿扩灌察捷提。酶切pGEM．TLR4戳及载体pTtracer-CMV2，纯化各自目的片段。由于在pTtraeer-CMV2载体，上的凝．2．骀质体包埋反义Tog样蹙体4质箍对内毒豢剿鞋鱼塞墼受塑启动子的序列中Kpnl

5、位于EcoRI蛇上游，按照碱基配对原则粘性采端相弱豹诱溺荔予连接，掰戳逶遘DNA连接爱寂藐镬pGEM—TLR4矮簸瓣l酶切产物反向连接到pTtracer-CMV2载体上，形成pTtracer-CMV2反义TLR4麟粒。二、反交TLR4矮粒与空自旗粒转染枣飘C57／BL用脂质体DOTAP包埋pTtracer-CMV2反义TLR4质粒积pTtracer-CMV2黧鑫霹爨蠹羧(100P．IDOTAP／1501／．gDNA矮粒)。当馕稳瓣与蟹蕤戆券渡DMEM在无菌环境中混合放置30分钟后，以尾静脉给药的方式给予实验组脂质体反义Toll液达质粒2mi，对照组空白质

6、粒2ml，空白组生理盐水2ml，隧三天强佬，多莓强健两次宠成转染过稷。透过荧巍显激襞硷溅璇粒掰携带鹪绿色荧光蛋自(greenfluorescentprotein，GFP)报告蘩斑的表达，剡断转染是磷成功。三、及义瓢盈霹矮粒霹建毒豢蒯激零簸熬影响在实验室条件下用内毒素刺激小鼠C57／BL，观察3缎小鼠的生物学行为改变。用RT—PCR梭溅小鼠组织中TLR4mRNA的变化，论证反义TLR4瘦粒戆黉洚低体蠹TLR4mRNA敬表这。TLR4RT-PCR莓

7、携分蘩为：生游S’哦Cg悠CAl℃GG引舔筒KTTG一3’，下游S’—A]鸭GCACC甜广T毯AAGa-GAG

8、一3’。通过EUSA法检测胖瘸坏死因予，a浓度的变化，论证反义TLR4质j畿熊否降低体内细胞因子过凝分泌。从而对反义基阙疗法在内赫黎血症的治疗的价值传秘步的评徐。结聚。形成的pTtracer—CMV2反义TLR4质粒缀过DNA测廖诞实TLR4部分序列凑骥蜷反囱连接到pTtracer-CMV2载体童，谈骧pTtracer-CMV2反义TLR4覆粒已戒功构建。用脂质体分别包煅pTtraeer—CMV2反义TLR4质粒和空白质粒臌，转染入小懿体内，通过棱测质粒上携带的绿色荧光蛋白证嶷履粒己转染夺疑维缀串。通过对转染不周质粒小鼠用内毒素刺激后，观察其生物学反应的

9、麓异，证实反义TLR4质粒对减轻内毒豢的毒性作用是有效的。藉雳RT-PCR熬方法迁实反义TLR4霞荻麓簿羝组缀内TLR4mRNA麓表达，说明反义TLR4质粒发挥了其抑制靶溅躐的效果。朦质体包域艇义删样受体4质挫对内毒素刺激小鼠的影响嚣LISA法测定，j、鬣斑清静癌薛毵蠢予堪浓发，证实瓣瘩涿死爨子一a浓度降低，说明反义TLR4质粒对由内毒素舡症引起的细胞因子的过量分泌寿撵铡终焉。小结TLR4蹩痰毒素藉号转导翡关键健受钵。奉轿究逶过复爻基蠢按寒梅建pTtracer-CMV2及义TLR4质粒并且用脂质体包埋后转染入小鼠体内。pTtracer-CMV2反义TLR

10、4质粮可以降低经内毒索刺激小鼠的毒性反应，抑制组织内TLR4mRNA的表达，以及