核基质结合区对马铃薯Y病毒非翻译CP基因及反向重复片段介导抗病性的影响

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1、山东农业大学博士学位论文核基质结合区对马铃薯Y病毒非翻译CP基因及反向重复片段介导抗病性的影响姓名：迟胜起申请学位级别：博士专业：植物病理学指导教师：温孚江20040620关于学位论文原创性和使用授权的声明本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容

2、编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。‘保密论文在解密后应遵守此规定。论文作者签名：导师签名：遇目也起泷【易山东农业大学博士学位论文摘要病原介导的抗病性是一种RNA介导的抗病性，也是一种转录后基因沉默。实践证明利用病毒来源的基因材料培育抗病毒植物是植物抗病毒基因工程的一种潜在有效的策略。核基质结合区是真核生物染色体中可以与核基质结合的一段DNA序列。它通过与核基质结合，把染色体分隔成一个个环状结构。许多研究表明核基质结合区能增强基因的转录、提高和稳定转基因的表达。利用核基质结合区构建表达载体被证明是一利t提高基因表达的有

3、效方法。本研究以马铃薯Y病毒坏死株系(PVY”)的衣壳蛋白(cP)基因和烟草(NC89)为材料，拟通过将不同表达活性的MARs(TMl为弱MAR，TM2为强MAR)构建在能形成单链非翻译的pvyN-CP基因和形成hairpin．RNA结构的98bp反向重复结构表达盒外侧来转化烟草，探究不同表达活性的MARs对单链全长非翻译的pvyN-CP基因及反向重复结构所介导的抗病性差异。主要的研究结果和结论如下：1．不同表达活性的MARs对单链全长非翻译的PVY”．CP基因介导抗病性的影响(1)以表达载体pROKII为基础，用全长非翻译的pVyN-CP基因构建植物表达载体pR

4、PVYCPN，在此基础上构建了两个在表达盒两侧带有不同表达活性MARs的表达载体pRTMlCPNTMl和pRTM2CPNTM2。(2)以烟草栽培品种NC89为转基因材料，通过农杆菌介导的转基因策略将基因转入并整合到烟草中，经lOOmg／L的卡那霉素的筛选最终获得转化pRPVYCPN的To代转基因植株72株、转化pRTMlCPNTMl的T0代转基因植株369株和转化pRTM2CPNTM2的To代转基因植株344株。(3)转基因植株的抗病性分析表明，在转化pRPVYCPN的72株To代烟草植株中得到高抗的转基因植株6株，抗性比率为8．3％，而转pRTMlCPNTMl的

5、369株To代烟草植株中有58株高抗，抗性比率为15．7％，转pRTM2CPNTM2的344株T0代烟草植株有52株高抗，抗性比率占15．1％。带MARs的构建比不带MARs的构建抗性比率提高将近一倍，但在转pRTMICPNTMl(弱MAR)和转pRTM2CPNTM2(强MAR)所得到的烟草植株的抗病比率之间没有差异。(4)转基因植株总DNAPCR和Southernblot分析表明目的基因已经整合到植物基因组中，但转基因的拷贝数与抗病性无明显的相关性。(5)Northernblot分析显示抗病植株体内几乎检测不到RNA的存在，而感病植株体内核基质结合区对马铃薯Y病

6、毒非翻译CP基因及反向重复片段介导抗病性的影响却能检测到RNA的存在，表明抗病植株体内发生了转录后基因沉默，这种抗病性为RNA介导的抗病性。将MARs运用到RNA介导的抗病性上，在国内外还未见报道：结果显示MARs能提高转单链全长非翻译的PVyN．CP基因所介导的抗病性，但不同表达活性的MARs之间差异不明显。2、不同表达活性的MARs对反向重复结构所介导抗病性的影响(1)以表达载体pROKII为基础，构建了含有由PV中。-CP3’端的长152bp和98bp的短片段组成的98bp长的反向重复结构的植物表达载体pRIR250，在此基础上又构建了在表达盒两侧带有不同表

7、达活性MARs的植物表达载体pRTMllRTMl和pRTM2IRTM2。、(2)以烟草栽培品种NC89为转基因材料，通过农杆菌介导的转基因策略将基因转入并整合到烟草中，分别得到转基因烟草159、468、216株。(3)转基因植株的抗病性测试表明，在转化pRIR250的159株To代烟草植株中，得到高抗的转基因植株112株，抗性比率为70．4％，说明98bp的反向重复足以引起转录后基因沉默，并且由这种结构产生的hairpin．RNA比由全长非翻译PvYN—cP产生单链的RNA转录物所诱导的抗病性要高效的多，而转pRTMlIRTMl和pRTM2IRTM2没有获得抗性植

8、株。(4)