广州管圆线虫组织蛋白酶-Z基因的克隆表达及其免疫学鉴定

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1、中山大学硕士学位论文广州管圆线虫组织蛋[J酶．z的克隆表达及免疫诊断学初步研究广州管圆线虫组织蛋白酶一Z基因的克隆表达及其免疫学鉴定专业：病原生物学研究生：岳永亮导师：詹希美教授中山大学中山医学院寄生虫教研室(510089)中文摘要广州管圆线虫病(Angiostrongyliasiscantonensis)为一种人兽共患病，其病原体为广州管圆线虫Mngiostrongyluscantonesis(chen，1935)Doughert，1946]。广州管圆线虫幼虫在人体侵犯中枢神经系统，引起嗜酸性粒细胞增多性脑炎或脑膜炎。除大脑和脑膜外，病变还可波及小脑、脑干和脊髓

2、。主要病理改变为充血、出血、脑组织损伤及肉芽肿性炎症。病人最明显的症状和体征为急性且止痛药难以缓解的剧烈头痛和脑膜刺激征，还可伴有皮肤感觉异常，颈部运动疼痛、乏力，严重者可致昏迷甚至死亡。广州管圆线虫病主要流行于东南亚、南美及环太平洋国家和岛屿等地区。自从1944年台湾首次报道广州管圆线虫病以来，我国大陆不断出现新发病例的报道。在北京、浙江、云南等多个省份甚至出现了暴发流行。于2003年我国卫生部将广州管圆线虫病其列为新发传染病，说明该病在我国己引起高度重视。由于该病缺乏特异的临床症状和体征，常被误诊为其他神经系统疾病而错误治疗或延误治疗而造成严重后果。因此广州管

3、圆线虫病早期、准确的诊断在该病防治过程中起着非常重要的作用。本课题由：1．广东省政府一国家自然科学联合基金(u0632003)资助；2．973项目(2010CB530004)基金资助。中山大学硕士学位论文广州管圆线虫组织蛋白酶-Z的克隆表达及免疫诊断学初步研究临床诊断主要依据患者有吞食或接触含虫的中间宿主或转续宿主的经历及临床症状，以患者脑脊液中查到虫体为金标准，但此法检出率低。目前实验室最常采用ELISA法检测病人血清中的特异抗体。用于ELISA检测的包被抗原通常为粗抗原，然而与其他寄生虫有一定的交叉反应。近年来相继有报道使用纯化抗原作为ELISA包被抗原检测病

4、人血清和脑脊液中的抗体，在一定程度上降低了交叉反应。但获得纯化抗原不但费时费力而且要大量获得较困难。因此，筛选出具有高敏感性和特异性的抗原组分，获得其编码基因，表达融合蛋白对广州管圆线虫病免疫诊断研究具有重要意义。生物信息学分析表明广州管圆线虫的组织蛋白酶．Z(Cathepsin．Z)包含信号肽，且对其他寄生虫组织蛋白酶．z研究也提示该蛋白酶可能是分泌性的蛋白酶。作为分泌抗原，可能足广州管圆线虫病早期诊断的抗原候选分子。本实验对广州管圆线虫组织蛋白酶．z基因进行了克隆表达并对其在免疫诊断中的应用做了初步研究。研究目的1．利用基因工程技术克隆广州管圆线虫组织蛋白酶-

5、Z基因，运用生物信息学方法对其核苷酸及推导的氨基酸序列进行初步预测分析以了解蛋白质的特性；2．构建广州管圆线虫组织蛋白酶-Z基因原核表达系统，优化表达条件以获得融合蛋白的高效表达。3．利用westen．blouing和ELISA分析对其免疫原性及抗原性进行初步研究，以对其血清学诊断价值做出客观评价，为研制理想的广州管圆线虫病诊断试剂盒奠定基础。研究方法提取广州管圆线虫四期幼虫的总RNA，采用cDNA第一链合成试剂盒，根据说明书进行合成广州管圆线虫病四期幼虫的总cDNA第一链。利用生物信息学对广州管圆线虫组织蛋白酶．z进行结构及功能预测。去除信号肽的编码序列，设计特

6、异引物。PCR法体外扩增该基因，定向克隆至原核表达载体pET30a(+)构建广州管圆线虫组织蛋白酶．z原核表达体系，转化入E．coliBL21以建立广州管圆线虫组织蛋白酶-z重组融合蛋白的工程菌。IPTG诱导表达融合蛋白，表达产物经SDS．PAG分析及Wstem．bloting鉴定。优化表达条件使上述工程菌高效表达目的蛋白。亲和层TT中Il

7、大学硕士学位论文广州管铡线虫组织蛋白酶．z的克隆表达及免疫诊断学初步研究析法纯化分离目的蛋白，纯化蛋白免疫BALB／c小鼠研究其免疫原性及抗原性，Westen．blotting和ELISA法对分离纯化融合蛋白进行免疫学鉴定和检

8、测。研究结果1．获得了广州管圆线虫组织蛋白酶．Z基因的完整读码框，通过生物信息学分析，广州管圆线虫组织蛋白酶．Z基冈与多个物种的组织蛋白酶．Z基因同源，其中与新隐杆线虫的组织蛋白酶．z的同源性最高，一致性为82％，相似性为89％。具有构成真核生物半胱氨酸蛋白酶活性中心的三个氨基酸残基。该蛋白具有分泌型信号肽，未发现线粒体等亚细胞定位序列，没有跨膜序列。2．成功克隆扩增了目的基冈。构建的pET30a(+)-．4．cantonesis．Cathepsin．Z重组质粒经PCR鉴定、双酶切鉴定以及测序结果分析，表明成功构建了广州管圆线虫组织蛋白酶．Z基冈的原核表达体系。3

9、．将构建的