广州管圆线虫ldh基因的克隆、表达与免疫诊断价值初步研究

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1、广州管圆线虫LDH基因的克隆、表达及免疫诊断价值初步研究中文摘要广州管圆线虫LDH基因的克隆、表达及功能初步研究专业：病原生物学硕士生：程梅导师：詹希美教授摘要广州管圆线虫病是一种人兽共患寄生虫病，亦称为嗜酸性粒细胞增多性脑炎和脑膜脑炎(eosinophilicmeningitisormeningoencephalitis，EMorEME)，此病是由广州管圆线虫(Angiostrongyluscantonensis，AC)寄生于人体中枢神经系统而引起。该病在太平洋沿岸及太平洋岛屿国家和地区有暴发或散发流行，对人类危害较大，我国最早在台湾发现了首个病例，近年来我国大陆广东、

2、浙江、上海、辽宁、福建、天津等地出现多例广州管圆线虫病的疑似病例或确诊病例，在浙江和福建两省发生多次暴发流行，这些己引起了广大寄生虫学工作者和卫生部门的重视。随着广州管圆线虫中间宿主的不断扩散蔓延，以及人们饮食习惯的改变，该病作为食源性寄生虫病越来越危害到人民的健康，引起了我国卫生部门和世界卫生组织对该病的高度重视。卫生部在2003年将广州管圆线虫病列为我国“新发传染病”，在新出现的全球性威胁的传染病中有三种属寄生虫病，广州管圆线虫病就是其中的一种。但是到目前为止，该病尚缺乏有效的早期诊断、早期治疗和预防措施，而对广州管圆线虫基因组的研究才刚刚起步，对功能蛋白的研究更寥寥

3、无几，这限制了新型诊断抗原和防治药物的研发。利用分子生物学方法寻找有诊断价值和药物靶标价值的蛋白是消灭广州管圆线虫病的重要切入点之一。乳酸脱氢酶(LDH)是广泛存在于动物、植物及微生物细胞内的一种重要的广州管圆线虫LDH基因的克隆，表达及免疫诊断价值初步研究中文摘要同工酶，是糖酵解途径的末端酶，利用NADH为辅酶，催化丙酮酸和乳酸之间的氧化和还原反应。LDH的同工酶在组织分布，动力学特征，理化性质及免疫学特性等方面均有很大不同。在人体，LDH已成为一种常用的临床医用诊断用酶。已知绝大多数体内寄生虫能量代谢的主要途径是无氧糖酵解，因此研究寄生虫LDH与宿主LDH在分子结构及

4、功能上的差异对于寄生虫的能量代谢、寄生虫病的免疫诊断、疫苗研究和新抗虫药物的研发都有着重要的意义。研究目的：解析广州管圆线虫LDH基因的结构及其特点，构建LDH基因的原核表达系统，优化表达条件，鉴定重组LDH基因的免疫反应性，以期获得能用于广州管圆线虫病诊断的基因工程重组抗原。研究方法：从广州管圆线虫幼虫eDNA文库随机测序得到的全长Unigene中识别出编码LDH的基因，用生物信息学方法对其进行结构预测及同源性比较，用PCR方法从幼虫eDNA文库中扩增出该基因，测序，定向克隆到原核表达载体pET-30a(+)，在大肠杆菌BL21中表达，优化表达条件，得到高效表达的工程菌

5、pET-30a(+)-LDH，按照Ni—IDAHis·BindPurificationKit说明书纯化重组蛋白，用十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析。用广州管圆线虫病人血清及广州管圆线虫感染的不同时期小鼠血清进行免疫印迹鉴定纯化蛋白的免疫反应性，并进行ELISA分析。研究结果：1．广州管圆线虫LDH基因全长1008bp，编码335个氨基酸，氨基酸序列的理论分子量(Mw)为36．66kDa，等电点(pI)为8．38。氨基酸序列与秀丽隐杆线虫LDH的同源性最高，达72％(237／328)，与果蝇LDH的同源性为62％，与华支睾吸虫LDH、日本血吸虫LD

6、H的同源性分别为52％和55％，与刚地弓形虫LDH及恶性疟原虫LDH的同源性分别为25％和24％。LDH氨基酸II广州管圆线虫LDH基周的克隆、表达及免疫诊断价值初步研究中文摘要序列具有LDH的完整的保守功能域，预测的LDH活性位点位于第194—200位氨基酸；在第26—165位氨基酸存在LDH1N末端功能域，在第167—334位氨基酸存在LDH1C末端功能域。2．经PCR、测序分析及表达载体的双酶切鉴定分析，表明成功构建了LDH基因的原核表达载体。3．在优化表达条件下，重组的融合蛋白在大肠杆菌得到了有效的表达，融合蛋白的理论分子量为42．6kDa，与表达的融合蛋白的实际

7、分子量相符。表达产物经亲和层析纯化后得到纯化的融合蛋白。4．经western—blotting和ELISA分析，该纯化的重组蛋白能被广州管圆线虫病人血清及不同感染时期的小鼠血清所识别，有很好的敏感性，可望成为理想的诊断抗原。结论：1．获得了广州管圆线虫的未知基因LDH。2．获得了可以表达重组融合蛋白的大肠杆菌工程菌株pET-30a(+)一LDH蛋白。3．纯化的重组蛋白具有较好的免疫反应性，是潜在的免疫渗断侯选分子。关键词：广州管圆线虫，乳酸脱氢酶，基因表达，纯化，免疫印迹，广州管圆线虫LDH基因的克隆、表达及免疫诊断价值初步研