广州管圆线虫Cystatin的基因克隆、重组表达及鉴定

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1、广州管圆线虫Cystatin的摹冈克降、重组表达与箍定中山大学博士学位论文广州管圆线虫Cystatin的基因克隆、重组表达及鉴定专业：病原生物学博士生：刘玉红指导老师：吴忠道教授摘要研究目的广州管圆线虫病是一种食源性寄生虫病，人因生食含有广州管圆线虫第三期幼虫的淡水螺而感染。自2006年在北京广州管圆线虫病疫情暴发以来，广州管圆线虫的研究再次引起广泛重视。但有关广州管圆线虫的基础研究如关键致病基因的鉴定及其致病机制的报道较少。广卅I管圆线虫感染主要引起以嗜酸性粒细胞浸润为主的中枢神经系统炎症，因此，嗜酸性粒细胞的浸润及其免疫病理的调

2、节是研究重点，而虫源性分子的筛选与鉴定是研究的热点之一。半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)是一类广泛存在于病毒、细菌、动植物、哺乳动物体内的蛋白酶抑制剂，参与多种生理与病理过程，如蛋白质的分解代谢、感染与免疫、肿瘤的侵袭与转移等。Cystatin不仅具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，而且还具有免疫调节活性。有关研究发现，寄生虫分泌的cystatin样分子能下调宿主的免疫反应，可能还与寄生虫与宿主的共进化有关。但目前还未见广州管圆线虫cystatin样分子的研究报道。本课题组在开展广州管圆线虫基因组研究时，通过对EST序列的分析，发现

3、了一个具有cystatin特征的序列。在此基础上，我们开展了广州管圆线虫cystatin(AcCystatin)的功能研究，为阐明AcCystatin在寄生虫感染或寄生虫与宿主的相互作用中的精确机制提供依据。儿广州管圆线虫Cystatin的基囚克隆、霞组表达与鉴定中山大学博十学位论文研究方法1．利用在线生物信息学方法，对AcCystatin的基因编码序列及氨基酸序列进行分析。应用RT-PCR技术从广州管圆线虫第四期幼虫cDNA中扩增AcCystatin的全编码序列，并将其克隆入载体pGEX-4T-1中，构建原核表达AcCystati

4、n的重组质粒，并进行重组表达AcCystatin(rAcCystatin)。2．采用多种鉴定方法对rAcCystatin进行鉴定，包括半胱氨酸蛋白酶抑制活性、免疫学活性以及蛋白质谱鉴定等。3．用RT—PCR方法检测AcCystatin在虫体不同时期的表达。用免疫荧光定位方法检测AcCystatin在虫体的分布特点。4．免疫BALB／C小鼠，获得抗rAcCystatin的免疫血清；采用ELISA法测定免疫小鼠血清中特异性抗体滴度及其抗体亚型，用WesternBlot技术对rAcCystatin进行抗原性和免疫原性鉴定。5．分离培养大小

5、鼠骨髓来源的树突状细胞(BMDC)，利用流式细胞技术检测rAcCystatin对BMDC表型的影响。6．利用大小鼠腹腔巨噬细胞进行rAcCystatin诱导一氧化氮(NO)产生的体外实验，并根据生物信息学预测结果，对AcCystatin序列中可能的与刺激NO产生相关的结构域进行基因定点突变，构建表达突变体蛋白的原核表达重组质粒，并进行重组表达。7．采用细胞学技术评价AcCystatin的突变蛋白对巨噬细胞产生NO的影响。研究结果1．AcCystatin的序列特征①hcCystatin具有cystatin超家族成员的典型序列特征，为I

6、I类cystatin。②AcCystatin典型的序列特征含有保守结构域⋯半胱氨酸蛋白酶活性抑制结合区域(cystatinG—QVVAG～Pw)，理论上预测AcCystatin具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。AcCystatin序列中可能存在与NO活性有关的基序。③在同源进化上，AcCystatin与线虫cystatin较为接近，而与人、大鼠和小鼠的cystatin遗传距离较远。2．AcCystatin基因的克隆和表达①在生物信息学分析的基础上，从广州管圆线虫第四期幼虫cDNA中克隆到Ill广州管厕线虫Cystatin的皋冈克降、重组表

7、达与鉴定中山大学博士学位论文AcCystatin全编码基因序列；RT-PCR结果显示AcCystatin在第三期、第四期幼虫及成虫均有表达。②构建了rAcCystatin高效表达体系，并获得了具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的可溶性rAcCystatin。3．rAcCystatin的免疫学活性鉴定①WesternBlot结果显示：感染广州管圆线虫大鼠的血清不能识别rAcCystatin，而感染小鼠的血清能识别rAcCystatin。②rAcCystatin免疫小鼠可产生特异性抗体，并能识别AC粗抗原(包括ES、幼虫及成虫抗原的相应蛋白条带

8、)，其抗体亚型以IgGl增高为主，其次为IgG2b和IgG2a。③流式细胞检测结果显示：受rAcCystatin刺激后，大鼠BMDC的表型分子无明显变化(0162除外)，小鼠BMDC的表型分子表达明显增加(包括NtCII)。4．rAc