Pim3对急性肝损伤肝细胞凋亡的抑制作用

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1、摘要目的运用流体力学基因转染方法，将已克隆的Pim．3基因转染进入大鼠的肝脏内并用LPS／D．GaIN诱导急性肝损伤，观察转染后Bcl一2、p53等基因的表达变化及对肝细胞生长的影响。探讨Rm一3基因对急性肝损伤肝细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法32只大鼠随机分成四组(8只／组)。A组为正常对照组，B、C和D组分别以林格氏液、空载质粒和Rm一了基因重组质粒溶液预处理大鼠，1天后给予LPS／D．GaIN腹腔内注射诱导急性肝损伤，8h后或濒死期处死大鼠，采集肝组织标本。利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)表达水平；TUNEL分析检测细胞凋亡情况，并用底物显色法检测Caspase．3活性；

2、肝组织基因表达通过RT-PCR和Westernblot进行检测。结果1．固定后的肝组织冰冻切片在荧光显微镜下观察，C组和D组肝组织有大量GFP表达，而A组和B组则无GFP表达，表明质粒成功转染进入肝组织内，并在肝组织内出现高表达。2．肝组织TUNEL分析各组大鼠肝细胞凋亡指数(AI)，分别为：A组3．I％o-4：1．7％、B组83．1％4-12．6％、C组79．9％_4：13．4％和D组10．2％4-6．9％，所有受LPS／D．GaIN攻击的处理组大鼠肝组织的细胞凋亡指数均明显高于正常对照组，且B组和C组凋亡指数显著高于D组(P<0．01)，B组和C组间比较，差异无统计学意义(P>0．0

3、5)，提示尸砌．3基因的活体内转染可显著减轻LPS／D．GaIN诱导的肝细胞凋亡。3．肝组织Caspase一3活性测定显示各组大鼠分别为：A组107．14-75．0pmol／min．mg、B组728．84-185．8pmol／min．mg、C组643．5+242．9pmol／min．mg和D组250．1+84．3pmol／min．mg，所有LPS／D．GaIN攻击大鼠Caspase一3活性明显高于正常对照组，B组和C组显著高于D组(P<0．01)，而B组和C组问差异无明显统计学意义(P>0．05)，提示内毒素攻击诱导了大鼠肝组织Caspase．3的活性，而R聊一3基因的转染则抑制了其活性

4、。4．各组大鼠肝组织Pim一3mRNA的相对表达水平分别为：A组0．294-0．12、B组0．104-0．03、C组0．16+0．1l和D组0．634-0．18；Pf，，l一3蛋白质的相对表达水平分别为：A组1．124-0．56、B组0．61+0．48、C组0．374-0．29和D组2．524-0．62，D组mRNA摘要和蛋白质表达水平较A、B和C三组高(P<0．05)，A组表达水平较B、C组高(P<0．05)，B组和C组间则差异无统计学意义(P>0．05)，提示正常大鼠肝组织有Pim．3基因表达，LPS／D．GaIN的应用可显著抑制其表达，外源基因的转染则可引起P砌一3基因高表达。5．

5、各组大鼠肝组织Bcl-2mRNA的相对表达水平分别为：A组0．264-0．06、B组0．324-0．“、C组0．28+0．09和D组0．864-0．14；Bcl-2蛋白质相对表达水平分别为：A组0．91+0．22、B组0．854-0．19、C组0．844-0．23和D组1．934-0．76，D组mRNA和蛋白质表达水平较A、B和C三组高(P<0．01)，而A、B和C三组间比较差异无统计学意义(P>0．05)，提示Pim一3基因的应用促进了Bcl-2的表达。6．各组大鼠肝组织p53mRNA的相对表达水平分别为：A组0．574-0．38、B组1．174-0．71、C组1．234-0．85和D

6、组0．22士'-0．16，D组p53表达水平低于A组、B和C组(P<0．05)，A组低于B和C组(P0．05)，提示内毒素攻击诱导了大鼠肝组织p53高表达，R，，1．?基因转染则抑制了其表达。结论R册一3基因能抑制Caspase．3的活性、抑制p53的表达、促进Bcl-2的表达，并抑制肝细胞的凋亡。外源性尸砌一3基因的活体内转染可以有效地抑制的肝细胞凋亡，从而保护大鼠免于LPS／D．GaIN诱导的急性肝损伤的发生。关键词Pim一3基因；急性肝损伤；细胞凋亡；抑制作用1IIAbstractABSTRACTobjectiveToinvestig

7、atetheinhibitoryeffectandmechanismsofserine／threoninekinasePim一3geneonhepatocellularapoptosisinacuteliverinjury．MethodsThirty-tworatswererandomlydivideintofourgroups(eightforeachgroup)．GroupAwasnormalcontr01．GroupB，Can