Fmr1敲除小鼠大脑皮层蛋白质组和磷酸化组及FXS发病机制的研究

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1、2018届研究生博士学位论文分类号：学校代码：10269密级：学号：52141300026EastChinaNormalUniversity博士学位论文DOCTORALDISSERTATIONFmr1敲除小鼠大脑皮层蛋白质组和磷酸化组及FXS发病机制的研究院系：生命科学学院专业：生物化学与分子生物学研究方向：蛋白质组学指导教师：廖鲁剑教授学位申请人：余春雷2018年4月15日Dissertationfordoctoraldegreein2018Universitycode:10269StudentID:52141300026EastChinaNormalUniversityTitle:An

2、alysisofFmr1KOmicecortexproteomeandphosphoproteometounderstandthemechanismsofFragileXmentalretardationSyndromeDepartment:TheInstituteofBiomedicalscienceMajor:BiochemistryandmolecularbiologyResearchdirection:proteomicsSupervisor:LujianLiaoCandidate:ChunleiYuApril,2018华东师范大学博士学位论文摘要脆性X染色体综合征（Fragile

3、XmentalretardationSyndrome,FXS）是一种最常见的遗传性精神发育迟滞疾病。FXS在男性中发病率为1/4000,女性中发病率为1/6000。其主要症状表现为认知和行为缺陷、智力低下、语言学习和交流障碍,长脸、大耳、睾丸巨大。部分病人表现出自闭症（autism）的症状。FXS的发病原因是位于位于X染⾊体上Xq27位点的基因Fmr1（FragileXmentalretardationgene1）的5'端非编码区出现多于200bpCGG三核苷酸重复性突变，相邻的CpG岛高甲基化，导致Fmr1基因表达关闭和编码蛋白FMRP缺失。FXS的病理改变主要是大脑皮层神经元的树突棘密

4、度增加，形态更为细长和弯曲，缺少成熟的蘑菇样树突棘。由FXS导致的智力障碍给病人带来巨大的痛苦，患者从出生到生命结束这一漫长的病程给家庭和社会带来极其沉重的负担。目前仅有少数几种药物可用于改善部分症状。虽然有多种小分子化合物进入临床试验，但结果并不理想，其核心症状依然无药可治。⼤量研究表明在FXS病⼈外周组织和Fmr1KO小鼠神经元中多种激酶所介导的细胞磷酸化信号转导功能紊乱。FMRP蛋白的缺失引起神经元多种激酶信号通路异常，而且多表现在磷酸化⽔平的增加。此外，FMRP可能参与DNA损伤修复，有报导Fmr1敲除促进精母细胞的凋亡。FMRP是一个mRNA结合蛋白，主要起翻译抑制作用（调控新蛋

5、白合成）。在基因组和转录组的⽔平利用Fmr1KO小鼠对FMRP结合哪些mRNA，调控哪些mRNA的翻译，维持哪些mRNA的稳定性有过⼀系列的研究。发现FMRP主要结合在接近900个靶点蛋白mRNA的编码区。这些蛋白质包括突触前、后蛋白和与自闭症候群相关的蛋白，提示FXS发病与调控突触蛋白翻译紧密相关。研究蛋白质的翻译（即蛋白质合成）可能为揭示FXS病理机制提供帮助。III华东师范大学博士学位论文液相色谱-高分辨质谱联用为基础的蛋白组学技术将复杂的组织、细胞蛋白提取物利用胰酶降解为多肽复合物，再用液相色谱-质谱联用/⼆级质谱分析的方法得到多肽的⼆级谱图，结合完备的蛋白质序列数据库解析多肽序列

6、，进而大规模地鉴定特异蛋白质。本实验收集了Fmr1野生型和敲除小鼠大脑皮层，利用基于超滤辅助的样品制备方法，结合串联质量标签标记方法和高pH的反向色谱分离，结合高压液相色谱质谱连用分析获得大规模的定量蛋白质组数据。同时再利用二氧化钛纳米颗粒富集磷酸化多肽并用MotifX数据库预测了磷酸化位点的特征。利用磷酸化特异性抗体和靶向质谱的手段对结果进行验证，构建模拟磷酸化和模拟磷酸化缺失的突变体导入Hela细胞和神经细胞系中，用激光共聚焦显微镜观察其定位情况。再引入诱导凋亡的胁迫处理，分析应激条件下磷酸化的作用。FMRP通过结合靶蛋白mRNA进而调控蛋白质的合成。本实验利用甲硫氨酸类似物叠氮同型丙

7、氨酸（AHA）标记新合成蛋白质，用基于叠氮-炔反应的化学生物学⽅法直接富集新蛋白质，再用质谱检测并定量新合成的蛋白质。本实验结果表明小鼠大脑皮层中，共鉴定了4927个蛋白，上调蛋白56个，下调蛋白36个。这些差异表达蛋白主要富集突触上，主要与RNA结合、细胞器组装及细胞压力调节等通路相关。磷酸化水平上，共鉴定磷酸化位点7696个，其中上调139个，下调2个，这些差异磷酸化位点主要富集在细胞骨架蛋白结合、actin结合等通