abhd2基因敲除小鼠年龄相关性肺气肿及其发病机制的研究

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1、·中文论著摘要·Abhd2基因敲除小鼠的年龄相关性肺气肿及其发病机制研究刖舌肺气肿是一种慢性阻塞性肺疾病，其主要特点是肺泡结构的破坏、肺组织弹性的消失、肺泡腔的扩张。在世界范围内肺气肿是主要的慢性病之一，也是死亡的主要原因之一。肺气肿的很多分子生物学发病机制来自于研究啮齿类动物模型，包括基因操控技术构建的小鼠模型。关于肺气肿相关的研究概括如下。首先，肺组织发育缺陷导致肺气肿。例如，在血小板衍生生长因子A缺失小鼠模型中肺泡间隔肌纤维母细胞发育缺陷，从而导致肺组织发育异常。这些小鼠肺气肿的发病及进展继发于肺泡间隔发育不良，从而弹性纤维蛋白及肺泡间隔的缺

2、陷。然而这种由发育异常导致的肺气肿与发育正常的肺组织被破坏所致的肺气肿截然不同。第二，损伤因素内源性破坏蛋白酶与抗蛋白酶平衡。这种失衡促使组织水解，导致肺泡间隔基质蛋白的水解，从而导致肺泡间隔破坏。最初人们发现吸入木瓜蛋白酶气溶胶可引起肺气肿，目前通过对更多基因操控技术构建的动物模型的研究，发现蛋白酶活性的过强或抗蛋白酶活性的缺乏可导致肺气肿。第三，氧化剂／抗氧化剂失衡，肺组织中氧化剂和自由基的过剩促使细胞和组织损伤，这也是该病发病的主要起因之一。当氧化剂和抗氧化剂失衡并倾向于氧化剂过度产生或／和抗氧化剂缺乏，氧化应激便会产生。氧化应激不仅导致直接

3、肺损伤，而且激活分子机制，从而开启了肺部炎症程序。第四，最近研究认为肺实质细胞凋亡是肺气肿产生的一个关键步骤。动物肺气肿模型中已经显示出肺实质细胞凋亡异常升高现象。例如，Kasahara等证实了血管内皮生长因子受体(VEGF受体)信号传导途径是维持肺泡结构所必要的，VEGF受体的慢性阻滞可能会诱导细胞凋亡而引起肺气肿。此外，关于衰老、自身免疫的全新概念目前引起广泛关注，例如，衰老标志蛋白(SMP．30)缺乏可导致肺气肿。动物模型中T淋巴细胞介导的炎症反应在吸烟诱导的肺气肿发病机制中起重要作用，这种获得性免疫的证据已经得到了阐明，尽管和一些文献报道存

4、在一定的分歧。最后，炎症应答使蛋白酶／抗蛋白酶失衡、氧化剂／抗氧化剂失衡、细胞凋亡异常，从而成功构建肺气肿小鼠模型。这些不同的发病机制可以独立地或协同地直接或间接的损害肺泡结构，最终导致肺气肿。0．／13水解酶家族编码蛋白质的3个cDNAs从小鼠肺气肿模型肺组织cDNA文库中被克隆；这3个cDNAs被命名为彰p水解酶基因1、2、3。这三个a／13水解酶家族编码蛋白质均有一个单独的氨基端跨膜区。虽然这个基因家族编码的蛋白质通常表现出酶的生物学特性，例如脂肪酶，但这三个基因编码的蛋白所具有的功能尚不清楚。我们运用基因捕获、插入、诱变技术构建了一种Abh

5、d2基因敲除小鼠。虽然宫田等研究发现Abhd2蛋白(Abhd2基因编码)在肺泡II型细胞表达，但仍需要阐明它在肺脏中的功能。在这个研究中，我们证实了Abhd2敲除小鼠自发地、渐进性地形成肺气肿，且呈持续、进展状态。材料和方法1、基因敲除小鼠及鉴定基因型基因敲除鼠模型(Abhd2G俯)：利用基因捕获、插入、诱变技术构建了～种Abhd2基因敲除小鼠。在这项研究中，我们使用的实验鼠属于该鼠系的第十代(FIO)。运用PCR技术，以基因组DNA做模板，鉴定实验鼠基因型。2、IⅢA分析用Northern印记和逆转录PCR进行mRNA表达评估。Northernb

6、iot分析按试剂合说明书完成。RT．PCR技术分析中，RNA样本反转录是按照制造商的指示说明进行ThermoScrip删RT-PCR系统(InvitrogenTM)。基因特异性引物用来扩增每个目的基因片段。每一基因mRNA模板的数量与产量成正比例，PCR的产量由最优的实验循环次数完成的，而最优的循环次数是由实验决定的。Hprt被用来做内部标准。扩增的PCR产物通过溴化乙锭凝胶电泳，电泳带的密度运用ImageJ软件(1．38版，Oattp：／／rsb．info．nih．gov／ij／docs／index．html)进行辉度分析，统计学处理。3、Wes

7、tern印迹分析2将肺组织匀浆在裂解物缓冲液中同质化ant处理提取蛋白质。此裂解物缓冲液是由美国西格玛．奥尔德罩奇，圣路易斯公司生产，成份为HEPES50mmol／1，pH7．4，氯化钠150mmol／1，聚乙二醇辛基苯基醚0．1％，甘油10％，氟化钠1mmol／1，原钒酸钠2mmol／1，乙二胺四乙酸lmmol／1，和一种蛋白酶抑制剂混合物(1：100稀释度)。将蛋白提取物(每泳道60嵋蛋白质)在12％SDS．PAGE凝胶电泳，电泳后用聚偏氟乙烯膜(PVDF)(美国Millipore，Billerica公司)转膜。初级抗体及使用浓度分别为：山羊抗

8、小鼠Sflpal抗体(稀释度l：500；美国，圣克鲁斯；圣克鲁斯生物技术公司)，山羊抗小鼠Sflpb抗体(稀释度1：500