猪伪狂犬病毒野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断ELISA方法的建立

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1、分类号：S855.3单位代码：10183研究生学号：2016854021密级：公开猪伪狂犬病毒野毒吉林大学感染与硕士学位论文疫苗免（专业学位）疫鉴猪伪狂犬病毒野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断ELISA方法的建立别诊DevelopmentofanELISAmethoddifferentiatinginfectedfrom断ELvaccinatedanimalsofPRVISA方作者姓名：王杨法的专业：兽医硕士建立研究方向：兽医技术服务王指导教师：丛彦龙教授杨合作指导教师：赵荣茂博士吉培养单位：动物医学学院林大2018年06月学猪伪狂犬病

2、毒野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断ELISA方法的建立DevelopmentofanELISAmethoddifferentiatinginfectedfromvaccinatedanimalsofPRV作者姓名：王杨专业名称：兽医硕士指导教师：丛彦龙教授合作指导教师：赵荣茂博士学位类别：硕士论文答辩日期：2018年6月5日未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论文的全部或部分内容进行任何形式的复制、修改、发行、出租、改编等有碍作者著作权的商业性使用（但纯学术性使用不在此限）。否则

3、，应承担侵权的法律责任。吉林大学硕士学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交学位论文，是本人在指导教师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿声明研究生院：本人同意《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》出版章程的内容，愿意将本人的学位论文委托研究生院向中国学术期刊（光盘版）电

4、子杂志社的《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》投稿，希望《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》给予出版，并同意在《中国博硕士学位论文评价数据库》和CNKI系列数据库中使用，同意按章程规定享受相关权益。论文级别：■硕士□博士学科专业：兽医论文题目：猪伪狂犬病野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断ELISA方法的建立作者签名：指导教师签名：年月日作者联系地址（邮编）：吉林省长春市绿园区西安大路5333号吉林大学动物医学学院（130062）作者联系电话：15718843418中文摘要猪伪狂犬病毒野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断ELISA方法的建立猪伪狂犬

5、病毒（Pseudorabiesvirus，PRV）主要经消化道、呼吸道、空气及胎盘等进行传播。病毒感染后，猪可能终生带毒并持久排毒，目前尚无有效治疗药物，给养猪业带来巨大的经济损失。2011年底，我国山东、河南、河北等多个免疫了某PRV疫苗的猪场暴发了疑似PR的疫病，发病猪出现高温（40～42℃）、咳嗽、腹泻并伴随有系统性神经症状，新生仔猪死亡率高。病毒分离结果表明，引起此次发病的病原体是变异的PRV，这对伪狂犬病（Pseudorabies，PR）的防控提出了新的挑战。PRV基因组可编码多种蛋白质，其中gE蛋白是PRV主要的毒力

6、因子，在病毒跨神经元传播过程中发挥重要作用。以gE蛋白为靶点鉴别野毒感染与疫苗免疫的优势在于gE基因具有高度的保守性，表达于所有野毒株，并且gE糖蛋白抗体产生迅速且持续时间长，因此被用来作为PRV野毒感染与疫苗免疫鉴别诊断的首选靶标。目前大部分商品化的PRV弱毒疫苗和灭活疫苗均缺失gE基因，由于野毒感染猪的存在，单纯使用疫苗并不能根除PRV。因此，在PRV净化过程中，结合野毒感染猪与疫苗免疫猪的鉴别诊断方法，坚决淘汰PRV野毒感染猪是根除PR的根本措施。目前，我国主要依赖国外昂贵的试剂盒来鉴别诊断PRV野毒与疫苗毒。虽然国内一些

7、公司也有PRV检测的同类试剂盒，但效果较国外进口有一定差距。因此，有必要研发能准确鉴别PRV野毒感染与疫苗免疫的国产试剂盒。为建立PRV抗体检测间接ELISA方法，本研究通过PCR扩增出PRVgE基因优势抗原表位区片段gE37～243，将其与pET-32a(+)载体进行连接构建重组质粒。经过蛋白表达条件优化，获得可溶性表达的gE37～243蛋白。利用Ni-NTA亲和层析纯化的gE37～243蛋白免疫小鼠，经过辛酸硫酸铵纯化获得了2株PRV的单克隆抗体，以I期为PRV单抗阻断ELISA方法的建立奠定基础。利用纯化的gE37～243

8、蛋白作为包被抗原建立了PRV抗体检测的间接ELISA方法，并对抗原包被条件、血清稀释液、封闭液、一抗，二抗工作浓度、作用时间等进行优化，通过与商品化试剂盒进行对比检测，本研究所建立的ELISA方法的敏感性为93.33%，特异性为93.75%，批内以及批间变异系数