MLKL在鼠伤寒沙门菌黏膜感染中的作用及机制研究

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1、分类号：S852.4单位代码：10183研究生学号：2015851014密级：公开吉林大学博士学位论文MLKL在鼠伤寒沙门菌黏膜感染中的作用及机制研究EffectsandmechanismsofMLKLinSalmonellamucosalinfection作者姓名：于水星专业：预防兽医学研究方向：病原微生物与分子免疫学指导教师：杨勇军教授培养单位：动物医学学院2018年6月本研究由“国家重点研发计划项目”（2017YFD0501000）和“国家自然基金面上项目”（31372410）资助，在此表示感谢！ThisworkwassupportedbyNatio

2、nalKeyResearchandDevelopmentProgramofChina(No.2017YFD0501000),andNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.31372410).中文摘要MLKL在鼠伤寒沙门菌黏膜感染中的作用及机制研究MLKL是一种假激酶蛋白，最初作为RIPK3的特异性底物被发现，是目前发现介导细胞坏死性凋亡信号的最下游效应分子。由于MLKL的N端四螺旋束功能区具有与生物膜结合并介导生物膜打孔或透化的特性，因此MLKL被认为是细胞发生坏死性凋亡的执行者。目前，关于MLKL生物学功能的

3、报道主要集中于细胞死亡领域，其介导的细胞坏死性凋亡参与金黄色葡萄球菌的局部和全身性感染以及某些自身炎症性疾病的发生。然而，MLKL是否参与调节肠道黏膜屏障功能并不清楚。沙门菌感染引起的肠炎严重危害畜牧业发展和人类健康，是全球重要的公共卫生问题。研究调节肠道黏膜免疫反应的分子机制，找到干预靶标，有利于沙门菌感染性肠炎的防控。本论文对MLKL在宿主防御沙门菌黏膜感染中的作用和机制进行了较为深入的研究。利用WT和MLKL-/-小鼠构建沙门菌感染性肠炎模型，首先分析MLKL是否影响宿主对沙门菌的易感性。结果发现，与WT小鼠相比，MLKL-/-小鼠对沙门菌黏膜感染更

4、为易感，主要表现为小鼠存活率显著降低、体重减轻更为明显，且在沙门菌感染48h后，伴有以盲肠重量减轻、杯状细胞减少、黏膜下层水肿明显、肠上皮完整性破坏明显、大量的炎性细胞浸润以及炎性介质产生等为主要特征的肠道病理损伤。由于沙门菌经消化道进入宿主体内后，突破肠道黏膜屏障并扩散至系统位点，引起宿主的胃肠炎、败血症及全身性感染（伤寒症）等。因此，我们推测沙门菌感染后MLKL-/-小鼠体现的严重肠道炎症和全身症状可能伴随细菌的大量定殖，实验证实沙门菌感染48h后，MLKL-/-小鼠盲肠组织和肠系膜淋巴结（肠道位点）与肝脏和脾脏（系统位点）均定殖了大量的细菌。总之，沙

5、门菌感染后，MLKL-/-小鼠存活率降低，组织损伤严重，炎性反应加剧，沙门菌入侵和扩散增多，说明MLKL有助于机体抗沙门菌黏膜感染。肠道黏膜屏障功能的完整性在防御肠道病原入侵和扩散中起重要作用。为了探究MLKL是否通过促进黏膜屏障功能完整和维护肠道稳态实现其抗感染作用，我们进行如下实验：首先，通过AB-PAS染色和免疫组织化学方法检测盲肠组织I中黏蛋白的表达情况。结果发现，在沙门菌感染48h后，与WT小鼠相比，MLKL-/-小鼠盲肠组织中黏蛋白的表达显著减少，且粘液的主要组成成分mucin2表达也显著减少，说明MLKL缺失导致肠道黏膜化学屏障受损更严重。肠

6、上皮细胞的更替（增殖和凋亡）也是维护肠道组织平衡和屏障功能的要素，通过免疫荧光和TUNEL染色发现，在沙门菌感染48h后，尽管两种基因型小鼠肠上皮细胞的增殖无明显差异，但MLKL-/-小鼠肠上皮细胞的凋亡明显增加，说明MLKL信号参与调节组织平衡以维持肠道黏膜层的完整，进而限制沙门菌的入侵。此外，通过实时荧光定量PCR、免疫组织化学和免疫蛋白印迹检测盲肠组织中紧密连接蛋白的表达情况。结果发现，在沙门菌感染48h后，尽管两种基因型小鼠盲肠组织中occludin和ZO-1的表达无明显差异，但与WT小鼠相比，MLKL-/-小鼠盲肠组织中claudin-3的表达显

7、著减少。与此同时，在体应用葡聚糖荧光探针检测肠道渗透性的变化情况，发现在沙门菌感染48h后，与WT小鼠相比，MLKL-/-小鼠肠道的渗透性显著增加，说明MLKL-/-小鼠的肠道黏膜屏障功能更易被破坏。上述结果表明，在MLKL基因缺失后，肠道黏膜屏障功能和肠道稳态更易被沙门菌所破坏。然而，上述结果还不能准确揭示MLKL的保护机制，例如不能明确脆弱的肠道黏膜屏障、过度的炎症和增多的入侵沙门菌之间的因果关系，因此进行沙门菌急性感染实验。结果发现，在沙门菌感染6h后，与WT小鼠相比，MLKL-/-小鼠肠道位点的细菌定殖数量有明显的增加趋势，然而两种基因型小鼠的肠炎

8、并不显著，且黏蛋白的表达也无明显差异。尽管感染后MLKL-/-小鼠