槲皮素抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应机制及其与AMPK的关系

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1、分类号：学校代码：10165密级：学号：201511000895硕士学位论文槲皮素抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞炎症反应机制及其与AMPK的关系作者姓名：刘明月学科、专业：微生物学研究方向：微生物生化导师姓名：谢明杰教授2018年04月槲皮素抗脂多糖诱导下RAW264.7细胞炎症反应机制的研究及其与AMPK的关系辽宁师范大学硕士学位论文摘要炎症反应是指具有血管系统的活体组织对损伤因子产生的防御反应，是机体抵制外界刺激的一种重要防御机制。适当的炎症反应对机体有免疫增强的作用，但当炎性因子的含量大于机体自卫系统的清除能力

2、或长时间地刺激机体时，可发生级联放大效应，引起急、慢性炎症反应，严重时可形成全身炎症反应综合征（SIRS），危及患者生命。目前的研究认为，脂多糖（lipopolysaccharide,LPS)是引起SIRS的主要原因。LPS的效应细胞主要是单核巨噬细胞系统，当LPS作用于细胞后，可与细胞膜上的特异性受体TLR4结合，经复杂的信号通路传递，激活核转录因子κB（Nuclearfactor-κB,NF-κB）和激活子蛋白-1（activatorprotein1,AP-1）的活性，通过调节细胞内炎症相关基因的转录和表达，来介导炎症

3、的产生。目前，针对LPS引发的炎症反应，主要采用抗生素类药物如多黏菌素B、地塞米松、氢化可的松和布地缩松等药物进行治疗。但由于这些药物的长期使用会引起许多不良反应，如降低机体免疫能力、加重感染、增加对肾脏的损伤等，极大地限制了它们在临床中的应用。因此，从天然产物中筛选抗炎效果好，毒副作用低和来源广泛的抗炎药物，逐渐成为新型药物研发的主要方向。槲皮素是一种黄酮类化合物，作为我国传统中药普遍存在于植物的花、叶、果实中。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedproteinkinase,AMPK)是一种进化保守的丝氨酸/苏

4、氨酸蛋白激酶，被称为“细胞能量调节器”，在维持细胞和机体能量平衡中发挥重要作用。近年来发现，AMPK的活性与炎症反应密切相关。已有的研究结果显示，槲皮素对LPS诱导的小鼠SIRS模型具有显著的治疗效果。且能够在多种脂肪细胞中激活AMPK发挥代谢调节作用。故本实验以LPS诱导RAW264.7的细胞为炎症反应的细胞模型，研究了槲皮素对炎症的抑制机制及其与AMPK的关系。具体的研究结果如下：1.MTT结果显示，5-20μM的槲皮素干预巨噬细胞24h后，与对照组相比，细胞存活率依次为98.9%、96.7%和95.5%，表明槲皮素在

5、5-20μM的浓度范围内对RAW264.7细胞的活性无明显影响(P＞0.05)，因此本文选取5、10和20μM浓度的槲皮素用于后续的实验。2.Elisa和Griess结果显示，槲皮素能显著抑制RAW264.7细胞分泌促炎介质TNF-α、PGE2和NO。不同浓度的槲皮素(5、10和20μM)干预细胞后，与LPS组相比TNF-α、PGE2和NO的分泌量均显著下降（P<0.01），呈浓度剂量依赖。其中20μM槲皮素对TNF-α、PGE2和NO的抑制率分别为77.0%、68.2%和52.9%（P<0.01）。表明槲皮素具有显著的抗

6、炎效应。-I-槲皮素抗脂多糖诱导下RAW264.7细胞炎症反应机制的研究及其与AMPK的关系3、RT-PCR结果显示，槲皮素能不同程度地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎介质TNF-α、iNOS、和COX-2的mRNA表达量。其中20µM的槲皮素，与LPS组相比，对TNF-α、iNOS和COX-2的mRNA表达的抑制率分别为63.37%、60.38%和54.06%（P＜0.01）。表明槲皮素能够通过抑制促炎因子基因的表达来发挥抗炎作用。4、Westernblot结果显示，槲皮素可剂量依赖地抑制LPS诱导的RAW26

7、4.7细胞中的转录因子NF-κBp-p65、c-jun和c-fos的蛋白水平。其中20µM的槲皮素，与LPS组相比，对NF-κBp-p65、c-jun和c-fos蛋白表达的抑制率分别为76.77%、73.14%和70.62%（P＜0.01）。表明槲皮素能够通过抑制转录因子的蛋白表达来发挥抗炎作用。5、Westernblot结果显示，槲皮素能提高LPS诱导的RAW264.7细胞内AMPK蛋白的磷酸化水平。与LPS组相比，5、10和20µM的槲皮素使p-AMPKα1的蛋白表达量分别提高了1.82倍、2.25倍和2.92倍（P＜

8、0.01）。由此推测槲皮素的抗炎作用与激活AMPK通路有关。6、Westernblot结果显示，AMPK激活剂和槲皮素均能显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞中NF-κBp-p65、c-jun和c-fos的蛋白表达水平（P＜0.01），表明槲皮素可通过激活AMPK蛋白的磷酸化水平来发挥抗炎作用。关键