冬虫夏草分离株的分子鉴定及主要活性成分测定

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1、食用菌EDIBLEFUNGI2009(5)冬虫夏草分离株的分子鉴定及主要活性成分测定尹小武李卓涵刘书畅董德贤李荣秀(上海交通大学生命科学与技术学院，上海闵行200240)摘要对冬虫夏草分离株进行DNA鉴定，测定其固体培养培养菌丝体(改良PDA培养)，液氮冷冻研磨至粉末状，加入菌丝体中虫草多糖、腺苷和虫草素。方法采用PCR技术，以300L溶菌酶裂解液(10mmol／LZnC12，lOmg／mL溶菌酶)，rDNA—ITS区为分子指标，对冬虫夏草分离株进行测序和分析；37℃恒温反应1．5h；加200LSDS裂解液(100mmol／LNaC1，分别用苯酚一硫酸法测定虫草多

2、糖，反向高效液相色谱法测定50mmo~LTris，10％SDS，pH8．O)，65℃水浴锅中处理10min；腺苷和虫草素。结果将所测得的冬虫夏草分离株18S一28SrD—1200g离心5min，吸取上清后加入等体积氯仿一异戊醇(24：1)NAITS序列与Genebank数据库进行相似性分析，发现与萃取5min，离心；转移上层水相，加入0．5倍体积的乙酸铵，AB067721(Hirsutellasinensis，日本)完全相同，与AJ309359等体积的异丙醇，室温沉淀20rain；1200g离心10min，75％(Hirsutellasinensis，贵州大学)相

3、比在544位多一个G，从分子的乙醇洗涤沉淀；沉淀用10mmol／LTfis(pH7．6)溶解。水平上证明了该分离株为冬虫夏草的真正无性型一中国被毛1．2．1．2I区引物设计及PCR扩增引物设计：PCR扩增孢；菌丝体中虫草多糖、腺苷和虫草素分别为16．81％~0．669％，引物为真核生物ITS扩增通用引物ITS4和I5t01，由上海博亚(342．7~5．20)g幢、(1O-41±l-32)g幢。生物公司合成。引物序列为：r4：5一TCCTCCGC1TrATTG关键词中国被毛孢虫草多糖腺苷虫草素分子鉴定ATArGC一3．ITS5：5一GGAAGTAAAAGI℃GTAA

4、CAAGG一3。文章编号1000—8357(2009)05—0020—03PCR反应体系：5L10xSuperTaqbufer，4LdNTP冬虫夏草是我国传统名贵中药，冬虫夏草提取物已被用(2．5mmol／L)，0．5LITS4、ITS5(10mmol／L)弓l物，0．6L来治疗高血糖症、呼吸系统疾病、肝病、肾衰竭[1J，并作为抗癌SuperTaq，4L模板；反应程序为：94℃预变性5min，进人循药物和抗氧化剂等弭。冬虫夏草的主要活性成分包括虫草多环，94℃变性1rain，55℃退火1rain，72cc延伸1rain，30个循糖，腺苷和虫草素，三者已被建议作为控

5、制虫草质量的标准。环，最后72℃延伸7rain。取lOL反应产物进行0．8％琼脂糖目前，与冬虫夏草有关的无性型菌种已报道有22个学凝胶电泳检测。PCR扩增产物直接进行测序，由Invitrogen公名，涉及13个属。经过多年争论，2005年10月，中国菌物学司通过双向测序完成(上海英骏生物技术有限公司)。会在北京召开了“冬虫夏草及其无性型研讨会”，确定中国被1．2-2茵丝体主要活性成分测定毛孢(Hirsutellasinensis)为冬虫夏草的唯一无性型菌种问。采1-2．2．1虫草多糖测定供试品制备：从改良PDA【培养用固体培养基培养虫草无性型菌丝对比液体深层发酵，

6、具有基()：马铃薯200，葡萄糖20，酵母粉1，胰蛋白胨1，琼脂l8]设备简单、发酵条件易控制、培养物中全部营养和保健成分均平板上切取中国被毛孢固体培养菌丝体，瞬时加热融化所带可充分利用等优点嘲。但在有关冬虫夏草活性成分含量测定的少量培养基后，用双蒸水洗涤菌丝体3-4次，45℃烘干至恒文章中，研究材料多为天然的冬虫夏草和发酵菌丝体[61-[91，尚重，研磨成粉。将称量好的虫草粉按1：10的比例加入相应体未见到测定中国被毛孢固体培养菌丝体活性成分的报道。因积的蒸馏水，pH8．0，超声20min，100℃热水浸提1．5h，离心而，试验首先用ITS序列分析法确定所得冬虫

7、夏草分离株的取上清。重复上述步骤2次，合并所有上清，加入4倍体积无种类，然后分别用苯酚一硫酸法、HPLC法测定分离株固体培水乙醇，4℃沉淀过夜，1200g离心15min，沉淀经真空冷冻养菌丝体中虫草多糖、腺苷和虫草素含量，对进一步开发利用干燥后，用蒸馏水溶解、定容，4~C冰箱放置备用。该无性型菌株的药用价值具有重要意义。标准曲线的绘制：精确称取无水葡萄糖适量于100mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，配成0．1003mg／mL的葡萄糖对照1材料与方法品溶液。取5mL溶液于50mL容量瓶中定容(含葡萄糖1．1试验材料冬虫夏草分离株来自青藏高原，现由本实验100．3txg,

8、／mL)，