碱性成纤维细胞生长因子基因诱导表皮细胞去分化的实验研究

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1、中文摘要目的1．构建碱性成纤维细胞生长因子基因真核表达载体pEGFP—C3一bFGF；2．将pEGFP—C3一bFGF转染至人表皮细胞，观察基因瞬时表达情况及表皮细胞的形态和表型改变，建立bFGF基因诱导表皮细胞去分化的体外实验模型；3．检测FGFR2在不同发育时期胎儿皮肤中的表达和分布，初步探索bFGF调控表皮细胞去分化的分子机制及FGFR2在皮肤发生、发育中的作用，为寻找调控表皮细胞去分化的内在驱动力提供实验基础，为深入研究皮肤的创伤修复与再生提供实验参考。方法1．参考分子克隆技术，采用PCR法从PBR322一bFGF质粒中扩增bFGF基因，同时

2、在其两端引入HindⅢ和EcoRI限制性内切酶酶切位点，将bFGFcDNA定向插入pEGFP—C3的多克隆位点中，构建真核表达质粒pEGFP—C3一bFGF，并对重组子进行DNA序列测定o2．采用脂质体(LipofectamineTM2000)转染法，将pEGFP—C3一bFGF转染至人表皮细胞系HEKa细胞中，在荧光显微镜下观察基因瞬时表达情况及细胞形态。以同期培养的表皮细胞及pEGFP—C3转染的表皮细胞作为阴性对照，免疫细胞化学染色和免疫荧光标记法检测实验组及对照组细胞形态的改变和细胞中B．整合素、CKl9、CKl4及CKl0表达的差异。采用R

3、T—PCR和Western—blot进一步检测pEGFP—C3一bFGF转染后表皮细胞表型的改变，建立bFGF基因诱导表皮细胞去分化的体外实验模型。3．对不同发育时期胎儿皮肤取材、固定、制成石蜡切片，S—P法检测FGFR2的表达及分布。结果1．构建了含有bFGFcDNA的真核表达载体pEGFP—C3一bFGF。2．荧光显微镜下观察pEGFP—C3一bFGF基因转染率为31．6％，转染阳性细胞体积小，呈圆形或圆梭形，核质比大。免疫细胞化学染色结果显示，实验组细胞中CKl9、CKl4表达增强，CKl0表达减弱。免疫荧光染色结果显示，转染阳性细胞主要在细胞

4、核、胞浆和胞膜中表达CKl9和CKl4，在胞膜上弱表达BI整合素，而CKIO表达为阴性oRT—PCR结果显示，pEGFP—C3一bFGF转染后表皮细胞中CKl9、CKl4mRNA的转录水平明显上调，而CKl0的mRNA表达明显下降。Westernblot检测结果表明，pEGFP—C3一bFGF转染后表皮细胞中CKl9、CKl4的表达明显增强，而CKIO的总体表达减少opEGFP—C3一bFGF转染后表皮细胞发生去分化，重新获得干细胞的表达标志。3．胚胎发育期FGFR2在表皮细胞表达较弱，甚至呈阴性表达。表皮分层期时，表皮层开始增厚，并可见毛囊的初级原

5、基；FGFR2在表皮层和毛囊初级原基内呈弱阳性表达。毛囊形成期时，毛囊的结构初步形成，体积细小，形态幼囱垂直匿堂陵亟±巫塞生堂焦迨塞(兰塑2堡2稚；FGFR2主要在毛母质细胞内表达，并且随着胎龄增加，表达范围逐渐扩大，表达量逐渐增多。毛囊发育成熟期后，毛囊的结构发育相对成熟，FGFR2则在表皮层、毛细血管内皮细胞及皮脂腺的导管部均有表达，尤其在毛母质细胞呈强阳性表达。结论1．将bF-GF基因插入pEGFP—C3的c末端，可以提高bFGF在真核细胞中的表达，而且不影响其目的蛋白的结构和功能。2．pEGFP—C3一bFGF能够转染至人表皮细胞并表达，在p

6、EG-FP—C3一bFGF转染作用后，表皮细胞重新程序化，并获得其前体干细胞的某些潜在能力，表达表皮干细胞的一些未分化蛋白，成功建立bFGF基因诱导表皮细胞去分化的体外实验模型，为进一步阐述bFGF调控表皮细胞去分化的分子机制提供实验基础，为寻找调控表皮细胞去分化的内在驱动力提供实验参考。3．FGFR2在胎儿皮肤中的表达与分布与毛囊的发生发育密切相关oFGFR2的表达上调可能促进毛囊干细胞的增殖，并诱导其定向分化形成终末组织功能细胞。关键词碱性成纤维细胞生长因子基因转染表皮细胞去分化成纤维细胞生长因子受体一2胚胎发育2Experimentalinve

7、stigationoftheinductionofepidermalcellstodedifferentiatewithpEGFP—C3一bFGFAbstractObjective1．Toconstructarecombinantplasmidcarryinghumanbasicfibroblastgrowthfactor(bFGF)．2．ToinvestigatewhetherhumanepidermalceilscouldbetransfeetedwiththeeukaryoticexpressivevectorofpEGFP—C3一bFGFan

8、dexpresstheexogenousgene．Mean—whiletoinvestigatetheded