蛋白激酶c抑制剂诱导表皮细胞去分化及micrornas差异表达的研究

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1、分类号：密级：UDC:学号：416523212141南昌大学专业学位研究生学位论文蛋白激酶C抑制剂诱导表皮细胞去分化及microRNAs差异表达的研究DedifferentiationofepidermalcellsintoepidermallikestemcellsanddifferentialexpressionofmicroRNAsinducedbyproteinkinaseCinhibitor叶华培养单位（院、系）：南昌大学第一附属医院指导教师姓名、职称：毛远桂教授、刘德伍教授专业学位种类：临床医学专业

2、领域名称：外科学（烧伤）论文答辩日期：2015年5月27日答辩委员会主席：评阅人：2015年5月学位论文独创性声明学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得南昌大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名（手写）：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作

3、者完全了解南昌大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授权北京万方数据股份有限公司和中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》和《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》中全文发表，并通过网络向社会公众提供信息服务，同意按“章程”规定享受相关权益。学位论文作者签名（手写）：导师

4、签名（手写）：签字日期：年月日签字日期：年月日论文题目蛋白激酶C抑制剂诱导表皮细胞去分化及microRNAs差异表达的研究姓名叶华学号416523212141论文级别博士□硕士□院/系/所第一临床医学院专业外科学（烧伤）E_mail备注：□公开□保密（向校学位办申请获批准为“保密”，年月后公开）I摘要摘要目的探讨蛋白激酶C（proteinkinaseC,PKC）抑制剂GF109203X诱导表皮细胞去分化形成表皮样干细胞的可能性及诱导前后微小RNA（micro-RNA,miRNA）的差异表达分析。方法（1）采用酶

5、消化法分离培养人原代表皮细胞。（2）将获得的细胞随机分为2组，实验组：原代表皮细胞培养2d后加GF109203X，终浓度为10μM；对照组：同期分离的原代表皮细胞培养2d后加等体积二甲基亚砜（DMSO）。诱导2d后采用免疫细胞化学染色法对2组细胞行β1整合素、角蛋白19(cytokeratin19，CK19)、CK14、CK10单克隆抗体检测鉴定。（3）TRIzol法提取2组细胞总RNA并用RNeasyMiniKit纯化，使用NanoDropND-1000测量TM纯化后的RNA浓度，变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA

6、完整性，miRCURYArrayTMPowerLabelingkit标记样品并与miRCURYLNAArray(v.18.0)杂交芯片，Washbufferkit清洗芯片后使用AxonGenePix4000B扫描，GenePixpro6.0读取探针信号值，对采集数据进行标准化及差异表达分析，实时定量RT-PCR验证微阵列芯片检测结果的可靠性。（4）对部分差异表达miRNAs靶基因行功能富集分析。结果（1）实验组细胞群诱导培养2d后形成明显克隆，免疫细胞化学染色显示β1整合素、CK19及CK14呈阳性表达，CK1

7、0阴性表达；对照组细胞群培养2d无明显克隆形成，β1整合素、CK19及CK14呈阴性表达，CK10呈阳性表达。（2）筛选出实验组细胞中表达上调的miRNAs45个，表达下调的miRNAs34个。其中显著上调的miRNA有hsa-miR-1-3p，hsa-miR-374a-5p，hsa-miR-144-5p等；显著下调的miRNA有hsa-miR-31-5p，hsa-let-7c-3p，hsa-miR-514a-3p等。（3）实时定量RT-PCR对表达上调最显著的hsa-miR-1-3p及表达下调最显著的hsa-

8、miR-31-5p进行验证，与芯片检测结果具有较好的一致性。（4）miRNAs靶基因功能富集分析提示差异表达miRNAs参与细胞增殖与分化、细胞周期进展、凋亡等生物学过程。结论蛋白激酶C抑制剂GF109203X可诱导体外培养人表皮细胞去分化形成表皮样干细胞，并引起表皮细胞miRNA的差异表达。关键词：去分化，表皮细胞，蛋白激酶C抑制剂GF109203X，microRNA，表达谱IIAB