micrornas在小鼠内耳发育过程中差异表达及其对毛细胞分化作用的研究

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时间:2018-11-12

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1、中IIJ大学博士论文microRNAs在小鼠内耳发育过程中的差异表达及其对毛细胞分化的作用研究microRNAs在小鼠内耳发育过程中的差异表达及其对毛细胞分化的作用研究专业:耳鼻H因喉科学博士研究生:王仙仁导师:姜鸿彦教授中文摘要研究目的:毛细胞损伤性耳聋是临床常见病多发病,目前还没有较好的治疗方法。本研究试图通过观察不同发育阶段小鼠内耳微RNA(microRNAmiRNA)表达特征及变化规律,发现潜在的可能与毛细胞发牛和成熟有关的miRNA。体外研究某~migNA对内耳发育和毛细胞分化成熟的影响,可以更好的探讨miRN

2、A的作用机制,但目前世界上还没有建立可以稳定传代的非转基因哺乳动物毛细胞或其前体细胞。本文体外分离小鼠E11.5耳泡、建立小鼠内耳前体干细胞模型,并诱导分化,研究在小鼠内耳有特异表达的miRNA对体外培养的内耳前体干细胞分化的影响,并探讨其可能存在的机制。研究方法:提取12个受孕后13.5d(E13.5dpc)、E16.5dpc内耳总RNA,行miRNA芯片检测;收集E8.5dpc、E10.5dpc、E12.5dpc、E14.5dpc、E16.5dpc、E18.5dpc胚胎内耳、新生C57BL/6小鼠内耳(P1),做冰冻

3、切片,原位杂交检测miR-182、miR一194、miR.140等多个重要的miRNA时空表达;提取12个E13.5dpc、E16.5dpc胚胎内耳、新生C57BL/6小鼠内耳(P1)总RNA,qRT-PCR检测miR-i94、miR.183、miR.140等重要的miRNA表达。取孕后10.5—12.5d(El1.5dpc)C57BL/6胚胎,分离出耳泡,小心剔除周围组织。中性蛋白酶、胰酶消化,37℃培养。7天后用分化培养基培养,诱导细胞分化7天。收集分化和未分化细胞,RT-PCR检测干细胞/毛细胞前体细胞、毛细胞标记

4、分子。免疫荧光检测myosinIIVa,I中山大学博士论文microRNAs在小鼠内耳发育过程巾的差异表达及其对毛细胞分化的作用研究Mathl,Jagged2,p27鼬p1,F-actin。扫描电镜观察分化前后细胞形态。从C57BL/6鼠肝脏中提取基因组DNA,扩增包含miR.183家族成员的PCR产物,并定向插入腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV。将经pineI线性化的重组穿梭载体与腺病毒骨架质粒pAdEasy.1共转化感受态大肠杆菌BJ5183,通过同源重组获得重组腺病毒质粒pAd.miR.182、pAd.miR

5、.183、pAd.miR-96。将pAd.miR在人胚肾293细胞(HEK293)中包装并扩增出pAd.miR的重组腺病毒。从基因组DNA中扩增预测靶基因3'-UTRPCR产物,定向插入pRL.TK载体。用pAdTrack.CMV-miR、pRL.TK.utr、pGL-etl共转染COS2细胞,双荧光素酶法检测双荧光强度。qRT-PCR法检测内耳前体干细胞诱导分化前后miR—182表达,转染miR.182重组腺病毒、miR.182抑制剂,观察其对内耳前体干细胞分化的影响,荧光免疫法检测转染前后Tbxl表达量。研究结果:m

6、iRNA芯片检测了560个鼠miRNA,在耳蜗中有表达的有100多个,与E13.5dpc内耳表达的miRNA相比较,E16.5dpc有I/3表达量有变化,有56个miRNA表达差异在2倍以上。miR-140在耳泡形成期开始表达,先在kolliker器,Corti器,螺旋神经节,前庭上均有表达,后特异性的表达在内外毛细胞,前庭毛细胞和螺旋神经节上。qRT-PCR检测结果证实miR-140在内耳表达逐渐减少。miR-182与miR-140表达规律相似。耳泡体外分离培养3天后可以形成2种球,一种是实体球,一种空心球。RT-PC

7、R显示未分化的球主要表达Abc92,nestin等干细胞Marker,分化后的球表达mathI,myosinIIVa等毛细胞Marker。免疫荧光证实,细胞球分化后表达mathl,myosinIIVa,细胞表面可见纤毛样结构。限制性内切酶分析和DNA测序结果显示,重组腺病毒穿梭载体pAdTrack.CMV-miR构建正确,pRL—TK.utr构建正确。在HEK293细胞中成功包装并扩增出重组腺病毒rAd.miR-183、rAd.miR一182、rAd—miR.96。双荧光素酶报告系统证实Tbxl是miR-182的靶基因之

8、一。内耳前体干细胞增殖期miR—182表达量改变不明显,诱导分化后mR.182表达量明显增加。miR.182重组腺病毒促进毛细胞分化,Tbxl表达明显减少,miR.182抑制剂抑制毛细胞分化,Tbxl表达增强。II中lIJ大学博土.论文microRNAs在小鼠内耳发育过程·扣的差异表达及其对毛细胞分化的作用研究研究结

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