天然产物D181抑制TLR4信号通路介导的炎症反应

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1、南京大学硕士学位论文声明本硕士学位论文为本人在导师指导下完成的原创性工作的总结，除了引用相关参考文献以外，内容无任何抄袭他人已经发表或尚未发表的成果，试验数据和结果没有任何作伪，不涉及任何经济纠纷，特此郑重声明。刘贤钦2012年02月03日DECLARATIONThisistodeclarethatmydissertationwasoriginallyfulfilledwiththegreathelpofthesupervisoranddoesnotcontainanycribfrompublishedorunpublisheddataofotherauthors

2、exceptcitationsandcounterfeitresultsanddoesnotdealwithanyeconomicorpropertyclaims．xianqinLiu2012．02．03南京大学硕士学位论文JMJIMIJIIIIIIIIIIIIIIlIMIlIIIIIIIlIIIIJY2373711毕业论文题目：丞然亡物』!墨!控剑坠墼筐呈通路企昱的塞疰厦廑剑垫王猩专—20—09级硕士生姓名：割贤这指导教师(姓名、职称)：送亚竖塾援摘要Toll样受体(Tolllikereceptors，TLRs)是一类识别病原模式分子的受体超家族，主要表达于免疫

3、细胞。这类受体能识别不同的微生物，进而激活天然免疫和获得性免疫系统以及控制机体的免疫反应。其中TLR4是一种重要的TLR，它介导的信号通路主要参与炎症反应的发生并且与许多免疫相关疾病(如：肿瘤、病毒感染、自身免疫病等)的发生发展密切相关。因此，寻找新的能够调控TLR4信号通路的阻断物，可望为治疗TLR4信号相关的免疫疾病带来新希望。本研究试图从一系列海洋来源的共生菌产物中寻找能够调控TLR4信号通路的小分子化合物。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，为TLR4的配体。为此，我们利用从海洋共生菌获得的小分子化合物预处

4、理小鼠单核／巨噬细胞RAW264．7，再在LPS诱导后，检测这些细胞分泌NO的水平变化，筛选出能有效抑制NO产生的小分子化合物。我们发现，小分子化合物D179、D181及D182能有效抑制NO的产生。本研究以筛选出的D181为研究对象，对其抗炎作用的特点和机制进行了探索。1、小分子化合物D181能抑制促炎因子的表达：为分析D181的抗炎作用与其细胞毒性的关系，我们用CCK．8试剂检测细胞活力，发现D181(10～100uM)对RAW264．7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞的活力无影响，提示，在这种剂量范围内，D181的抗炎作用与其细胞毒性无关。用ELISA法及荧光定量PC

5、R分析了不同浓度D181对LPS诱导的小鼠巨噬细胞炎性因子蛋白及mRNA表达影响，ELISA法检测结果显示D181(6．25、25、100uM)南京大学硕士学位论文能剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264．7细胞和小鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF．u、IL．6、MCP．1和NO；荧光定量PCR分析结果表明，D181仅能剂量依赖性地抑制LPS诱导的RAW264．7表达TNF．a、IL．6和MCP．1，而对iNOs的表达无影响。用WesternBlot法分析了D181对LPS诱导的RAW264．7细胞iNOs蛋白表达发现，D181可剂量依赖性地抑制iNOs产生，提示D18

6、1抑制NO表达是通过抑制iNOs蛋白表达起作用的。2、小分子化合物D181能抑制TLR4信号转导：为了探索D181调控TLR4信号通路的机制，首先用流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞对FITC．LPS的结合和内吞能力，发现D181(25、100uM)不改变巨噬细胞的信号识别和吞噬功能。TLR4胞内信号通路分别由MyD88和TRIF来介导，其中MyD88依赖的信号通路主要经过MAPKs和NF．r,B，最终产生促炎因子(如TNF．仅、IL．6和NO等)；而TRIF依赖的信号通路除此之外，还经过干扰素调节因子3(II心3)通路，最终产生促炎因子以及I型干扰素和干扰素诱导基因

7、(如IFN．p、IF．10)。进一步分析了D181对TLR4胞内信号通路的影响，用WesternBlot法分析RAW264．7细胞NF．1cB信号通路中信号分子活化情况，结果显示，D181(25uM)能显著下调LPS诱导的It,Be的磷酸化和降解水平，同时也能抑制P65的磷酸化；免疫荧光法观察到D181抑制LPS诱导的NF．r,BP65的入核；荧光报告基因检测发现，D181可下调LPS诱导的NF．KB的活性；同时，D181能显著抑制LPS诱导的MAPKs中JNK的磷酸化，而对ERK和p38的磷酸化几乎不影响；荧光报告基因检测发现，D181降低LPS诱导的AP．1的

8、活性；另一