重组低氧诱导因子1α基因真核表达载体的构建和表达研究

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1、第一军医大学硕士学位论文重组低氧诱导因子1α基因真核表达载体的构建和表达研究姓名：傅锐斌申请学位级别：硕士专业：心血管内科指导教师：吴平生20030601英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称AngIIangiotensinII血管紧张素IIBSAbovineserulnalbumin牛血清白蛋白CHDcoronaryheartdisease冠心病DEPCdiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯DTTdithiothreitol二硫苏糖醇DMEMDulbecco’SmodifiedEagle’DMEM培养基MediumBGM．2．MVmicrovascularendot

2、helialcell微血管内皮细胞生长growthmedium-2培基EDlAethylenediaminetelxaaceticacid乙二胺四乙酸FBSfetalbovinese／'ll／n胎牛血清H球．1Q／ehypoxia-induciblefactor-1d／B低氧诱导因子．1Q／15H】“VEChumanmicrovascularendothelial人肺微血管内皮细胞CellHRPHorseradishperoxidase辣根过氧化物酶PCRpolymerasechainreaction聚合酶链反应PTCApercutaneoustransluminal经皮穿刺腔内

3、冠状动coronaryangloplasty脉血管成型术RTreverseWanscfiption逆转录VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子重组低氧诱导因子1Ⅱ基因真核表达载体的构建和表达研究中文摘要冠脉再通方法如PCI、cABG和溶栓治疗等，为缺血性心血管病治疗发挥了重要作用，有其自身的适应征、禁忌征和不同程度的局限性，科学家很早以前就想到了促血管新生治疗。血管内皮生长因子(vEGF)的发现，曾经让他们寄予厚望。但是进一步的研究表明，在VEGF单独刺激下，尽管血管网密度增加，但新生的血管不十分成熟，会出现血管扭曲、通透性增加，还

4、有可能触发肿瘤生长。而近几年才发现的转录激活因子一低氧诱导因子．1n(hypoxia-induciblefactor-1q，HIF一1Ⅱ)，已经被证实可以檄活低氧代谢和促血管新生基因的转录；在转基因小鼠体内实验证实，重组的H工F_la可以促进皮肤形态功能正常的血管新生。然而，正常氧的条件下，HIF-1n蛋白极易被降解和失活。本研究的目的就是重组构建人低氧诱导因子真核表达载体paDNA3．IV5一HisA—HIF～la的两种突变体pcDNA3．1V5-HisA—HIF—lⅡ一564Ala和pcDNA3．1V5一HisA—HIF—ld一564A1a-803A1a。研究这三种重组体在微

5、血管内皮细胞的表达，阐明突变对HIF．Icc表达和功能的影响，为组织水平和动物水平评价重组HIF-1a的生物学功能、尤其是它的促心肌血管新生功能打下基础，希望在分子水平为缺血性心血管病促血管新生治疗开辟新途径。方法用定点突变的方法将无突变型表达载体pcONA3．1v5一HisA—H工F_ld的第564位脯氨酸(Pro)密码子CCC突变为丙氨酸(Ala)密码子gcc，构建成单突变型HIF-1d真核表达载体pcDNh3．1V5-HisA-HIF—lⅡ一564Ala。在第一次突变的基础上，仍然用定点突变的方法将pcDNA3．1V5．HisA—HIF一1n一564Ala的803位天冬酰胺

6、(ASh)密码子aat突变为丙氨酸(Ala)密码子gct，构建成双突变型HIF一1o真核表达载体pcDNA3．1V5-HisA-HIF一1d一564Ala-803Ala。将无突变型表达载体及突变型表达载体，用脂质体法分别转入人肺微血管内皮细胞(INVEC)，westernblotting法、RT—PCR法和免疫荧光等方法检验转染细胞HIF一1d和下游基因VEGF的表达。结果测序证实，定点突变成功，构建出重组真核表达载体pcDNA3．1V5一HisA-HIF—la-564Ala和pcDNA3．IV5一His—HIF—laA-564Ala一803Ala；转化后的结果表明，转化突变型H

7、IF-Ia表达载体的细胞比转化无突变HIF—lⅡ载体的细胞HIF-1a蛋白明显增加，血管紧张素II刺激无突变HIF—la载体的细胞HIF-1Q蛋白表达增加；转化突变型HIF一1Ⅱ表达载体细胞的VEGF表达增强，以转化双突变型HIF-In表达载体细胞更明显。结论正常氧条件下无突变的HIF～1a蛋白容易被降解，这种降解可以被血管紧张素II抑制i而突变型HIF—la正常氧条件下不易降解。证实了HIF一1Ⅱ的564位脯氨酸是有氧条件下HIF-1a蛋白发生降解的靶点。正常氧条件下，双突变型