多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的研究

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1、黑龙江八一农垦大学硕士学位论文多重PCR检测猪瘟病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的研究姓名：刘建柱申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：朴范泽2003.6.1缩写词CSFClassicalSwineFeverCSFVClassicalSwineFeverVimsPPVPorcineParvovirusPRPorcinepseudombiesPRVPorcinepseudombiesvirusFAfluorescentantibodyENDExaltationofNDVRTReverseTranscriptionPCRPolymeraseChainReactionAMVase

2、ReverseTraanscriptasefromAvianMyeloblastosisVirus猪瘟猪瘟病毒猪细小病毒·猪伪狂犬病猪伪狂犬病毒荧光抗体试验鸡新城疫病毒强化实验反转录多聚酶链反应一种来自禽脑脊髓炎病毒的反转录酶SNserumneutralization血清中和试验IliAindirecthemagglutination间接血凝试验CTB--ELISAcomplextrappingblackingELISA复合捕捉封闭ELISAAC--ELISAantigen-．capture---ELISA抗原捕获ELISAC．ELlSAcompetitiveenzyme·lin

3、kedimmunosorbentassay竞争ELlSADot．ELISA斑点．ELISAHAorHIhemagglutinationorHA．inhibition血凝(抑制)试验CIEcountercurl'entimmunoelectrophoresis对流免疫电泳试验LATlatexagglutinationtestt乳胶凝集试验SECGASilver-enhancedcolloidalgoldassay银加强胶体金技术IFimmunofluorescence免疫荧光体染色技术RIAradioimmunoassay放射免疫技术IDTimmunodiffusiontest免疫

4、扩散试验cELlSAcompetitionenzyme．1inkedimmunosorbentassay竞争ELISAPCFIAparticleconcentrationfluorescenceimmunoassay颗粒浓缩免疫荧光试验多重PCR检测CSFV、PPV、PRV的研究摘要猪瘟、猪细小病毒感染、猪伪狂犬病是危害养猪业发展的一类重要的传染病，每年均给养猪业造成巨大的经济损失。为了减少这三种疾病给养猪业带来的巨额经济损失，广大兽医工作者在过去的100多年里，建立了许多用于检测和诊师宣三种疾病的方法，但这些方法大多仅限于常规的免疫学和血清学检测，只适用于流行病学调查，而不能够

5、确定是否正处于感染状态，并且都存在着敏感性差、特异性不强和，或耗时等缺点，无法满足临床上对猪瘟、猪细小病毒感染和猪伪狂犬病的诊断和检钡9需要。随着分子生物学研究的不断深入和PCR技术的出现，为动物传染病的诊断和检测提供了快速、敏感、特异和方便实用的方法。为此，本实验研究和建立了猪瘟、猪细小病毒感染和猪伪狂犬病的多重PCR诊断和检测方法，并对多重PCR扩增条件进行了优化，对其特异性、敏感性以及临床应用进行了研究。为进一步在临床上使用多重PCR方法诊断和检测这三种猪繁殖障碍性疾病提供参考。，本研究首先在GeaeBank中查出CSFV、PPV、PRv的所有已知序列。对病毒各塞困区进行同

6、源性分析，确定CSFV的E2基因，PPV的VP2基因和PRV的譬Ⅱ基因作为各病毒扩增的靶序列。利用DNAsis对上述保守区进行引物设计．并利用DNAstar对设计出来的3种病毒引物进行引物二聚体化、同源性和互补性分析，以避免引物之间形成稳定的引物二聚体和避免具有较高的同源性和互补性。最后确定了扩增片段为CSFV288bp、PPV575bp、PRV700bp的3种病毒的6条多重PCR引物。在此基础上，分别进行了各病毒单重PCR的检测，确定了各单重PCR扩增条件的范围，建立了这三种病毒单重PCR诊断方法。结果在退火条件CSFV为50．1．61．1℃40s、PPV为52．8-61．1℃

7、啦s、PRV为56．2-62．2"C40s时的扩增效果为佳，电泳条带清晰，杂带较弱，可获得较满意的扩增结果：其他步骤的反应条件以预变性舛℃3min、变性94℃30s、延伸72℃lmin、共30个循环、再经延伸72℃5min后、于4"C10min终止PCR扩增为宜。利用优化晤的PCR各扩增条件对各引物浓度、dNTP浓度进行优化，结果引物浓度以CSFV1．o-1．75pmol／ml，PPV1．0-1．75pmol／ml，PRVO．75．1．75pmol／ml为宜；dNTP浓度以CSF