白斑综合症病毒主要结构蛋白的重组表达及功能分析

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1、中山大学硕士学位论文白斑综合症病毒主要结构蛋白的重组表达及功能分析姓名：寸树健申请学位级别：硕士专业：医药生化与分子生物学指导教师：吴文言;徐安龙2003.6.1缩略词AcNPV口utographacalifomicanuclearpoly—hedrosisvirus)苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒Amp(Ampicillin)氨苄青霉素bis(N，N’-methylenebisacrylamide)N，N’一亚甲叉丙烯酰胺B—ME([3-mercaptoehtan01)B-巯基乙醇BSA(Bovineserumalbumin)牛血清白蛋白DAB二氨基联苯胺Ecoil(Escherichia

2、coil)大肠杆菌EB(Ethidiumbromide)溴化乙锭EDTA(Thylenediaminetetraaceticacid)乙二胺四乙酸EST(Expressedsequencetag)表达序列标签Gen(gentamicin)庆大霉素hr(hour)小时IPTG(Isoprophylthio-p—D-galsctoside)异丙基硫代-B．D．半乳糖苷Kan(kanamycin)卡那霉素KDa(Kilodalton)千道尔顿min(minute)分钟ORF(Openreadingframe)开放读码框PCR(Polymerasechainreaction)聚合酶链式反应PEG

3、(Polyethyleneglyc01)聚乙二酵PMSF(phenyl-methylsulfonylfluoride)氟甲基苯硫酰sec(second)秒SDS．PAGE(SDS-polyacrylamidegelelectrophoresis)SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳TE(Tris-EDTAbuffer)Tris-EDTA缓冲液TEMED(N，N，N，N’-Tetramethyleth)’lene-diamine)N，N，N，N’-四甲基乙烯二胺Tet(tetracycline)四环素Tris(Tris(hydroxymethyl)-aminomethane)三(羟甲基)氨基甲烷VP

4、2X(VP28，VP26andVP24)VP28，VP26和VP24蛋白名称的简写vp2x(vp28，vp26andvp24)vp28，vp26和vp24基因名称的简写w／v(weight／volume)重量／体积X—gal(5-Bromo-4-Chloro-3一Indolyl-B．D．Galactoside)B一半乳糖苷酶的底物，水解后呈蓝色白斑综合症病毒主要结构蛋白的重组表达及功能分析．摘要摘要以怼堑自堡堡盒壅堕耋(wssv)为研究对象，应用基因工程和生物信息学等现代生物学研究方法和技术手段对WSSV的三个主要的结构蛋白VP28，VP26和VP24进行综合分析。在利用昆虫细胞表达重组

5、蛋白以及构建蛋白序列生物信息学分析平台的基础上，对这三个蛋白进行结构与功能的分析和研究，以期在掌握WSSV三个主要结构蛋白理化特性及生理功能之后，能为WSSV侵染宿主细胞的机理提供实验证据和理论假设的数据支持。，／通过美国国家生物技术信息中心(NationalCenterforBioteehnologyfInformation，NCBI)网站上提供的vp28，vp26以及vp24基因序列，利用PCR进行DNA体外扩增获得三个WSSV主要结构蛋白的基因编码片段。应用Bac-to—Bac“系统构建重组昆虫杆状病毒，并将其导入昆虫细胞Sf9中进行真核系统表达。纯化后的表达产物用于制备鸡来源抗体

6、，分别获得了三个蛋白的抗血清。制备的多克隆抗体与天然来源的WSSV蛋白进行Western杂交分析，结果显示呈阳性反应，表明多克隆抗体可以识别变性条件下的天然蛋白。一个特别设计的细胞吸附实验用于进一步研究在WSSV侵染宿主细胞的过程中VP28和VP26结构蛋白所扮演的角色。实验结果显示，两个蛋白可以与对虾组织来源的细胞发生体外吸附反应，表明此两个蛋白可能参与WSSV侵染宿主细胞的初始阶段。这也部分验证了由计算机分析结果所得出的推论。作为一个新出现的病毒家族一Whispoviridae--的代表，WSSV的实验数据积累还不太多，相关的研究也不够深入。为了最大限度地对已有的数据进行利用和挖掘，

7、为确立理论提供参考，并指导今后研究的方向，我们在PC／Linux平台上构建了用于蛋白序列分析的生物信息学工作站，利用此工作站对获得的WSSV相关数据进行综合分析及归纳，并获得了一些有意义的结论。在蛋白属性方面，分析数据显示VP28，VP26及VP24三个结构蛋白在二级结构、跨膜结构域、抗原位点分布、理论大小、翻译后修饰等方面有着很高的相似度；在蛋白起源方面，这三个蛋白与任何已知的蛋白序列没有明显的同源性，但数据显示它们在氨基酸序列上